1.2试验方法
1.2.1重组质粒pT-UL2-RFP构建
重组质粒pT-UL2-GFP-gpt用限制性内切酶NheI-HF、BamH I-HF双酶切，切除重组质粒GFP-gpt表达盒，回收6.2 kb片段，质粒pT-RFPNX用限制性内切酶NheI-HF、BamH I-HF双酶切，回收大小为711 bp RFP片段，通过T4 DNA连接酶将RFP替换GFP-gpt，构建重组质粒pT-UL2-RFP。
1.2.2重组病毒的制备、纯化
DEV细胞适应毒接种CEF(MOI=0.01)，吸附1～2 h后，按Lipofectamine 3000说明书转染高纯度质粒pT-UL2-RFP。转染后72～96 h，观察细胞病变情况，待80%细胞产生病变后，反复冻融3次，接种于新鲜CEF单层的六孔培养板中，用含5%血清、1%双抗、1%琼脂的M199培养液覆盖，37℃、5%CO2培养箱中培养48～72 h。观察荧光，挑取单个有红色荧光的蚀斑，在细胞上重复多次传代，直至所有的蚀斑都带有红色荧光，确定为纯化的重组病毒。
1.2.3重组病毒基因组DNA的提取
取重组DEV病毒液437.5μL，加入蛋白酶K(20 mg/mL)12.5μL，10%SDS 50μL；56℃水浴1 h；分别用酚/氯仿/异戊醇(25∶24∶1)、氯仿各抽提一次；取上清，加入1/10体积3 mol/L醋酸钠和两倍体积的无水乙醇，-20℃放置30 min；12000 g离心10 min，去除上清后，70%乙醇洗涤沉淀一次，沉淀溶于30μL去离子水中，-20℃保存备用。
1.2.4重组病毒鉴定重组病毒DNA用鉴定
引物ORFC17F、ORFC17R进行PCR扩增，PCR产物送北京华大基因生物公司测序。
1.2.5一步生长曲线
将重组病毒及其亲本毒分别接种于8瓶25 cm2(MOI=0.01)的CEF中，接种后每隔12 h取出一瓶接毒细胞，收集细胞培养液上清作为上清样品，再加入1 mL含有1%FBS的M199细胞维持液，冻融后取上清作为细胞样品。将重组病毒及亲本毒的病毒悬液做10倍系列稀释，取4个适宜稀释度，接种新鲜的CEF单层96孔细胞培养板，每孔接0.1 mL，每个稀释度接5孔，37℃吸附1 h后每孔加入0.1 mL细胞维持液，37℃、5%CO2培养箱中培养5 d。观察致细胞病变效应(Cytopathic Effect，CPE)，记录每个稀释度出现CPE的孔数，按Reed-Muench法计算病毒TCID50，并绘制一步生长曲线。
1.2.6重组病毒的稳定性
将重组病毒接种CEF(MOI=0.01)，待80%细胞产生病变后，反复冻融3次，再接种CEF，按此方法连续传代12次。荧光显微镜下观察每代重组病毒的红色荧光表达情况。按1.2.3方法提取第5代、第10代、第12代病毒DNA，用鉴定引物ORFC17F、ORFC17R通过PCR鉴定外源基因RFP是否稳定存在。PCR产物送北京华大基因公司进行测序。
2结果与分析
2.1重组质粒pT-UL2-RFP的酶切鉴定
重组质粒pT-UL2-RFP用限制性内切酶NheI-HF以及BamH I-HF双酶切鉴定，得到大小约为6.2 kb和771 bp的两个片段(图1)，符合理论值。
