2.2.3诱导温度对CSP-MDA-7/IL-24表达的影响
诱导温度对CSP-MDA-7/IL-24重组蛋白的表达有很大影响。如图4所示，在其他诱导条件相同的情况下，培养温度为42℃时，CSP-MDA-7/IL-24蛋白表达含量占菌体总蛋白的54%，均高于其他温度。
图4不同诱导温度时重组菌
2.2.4诱导剂IPTG浓度对CSP-MDA-7/IL-24表达的影响
诱导剂IPTG通过诱导pET原核表达载体中的lacUV5启动子来过量表达T7RNA聚合酶，从而增加目的蛋白的表达。IPTG浓度对CSP-MDA-7/IL-24蛋白表达的影响如图5所示，在其他诱导条件相同的情况下，IPTG浓度为0.12 mmol/L时，CSP-MDA-7/IL-24蛋白表达含量占菌体总蛋白的25.2%。
图5不同IPTG浓度时重组菌
2.3正交试验优化表达条件
正交设计是一种快速、高效、经济，能够研究多因素不同水平的试验设计方法。通过正交试验分析影响重组菌BL21/pET21b-CSP-MDA-7/IL-24表达外源蛋白的主要因素，能够提高目的蛋白的表达量。通过正交试验L25（45）对诱导时间、培养基pH值、诱导温度和诱导剂IPTG浓度共四因素五水平进行优化（参数水平见表1）。图6为正交试验不同条件下目的蛋白的表达结果，正交分析软件分析四因素五水平对蛋白表达量的影响如表2（正交试验结果与分析）、表3（方差分析）。结果表明，诱导温度是CSP-MDA-7/IL-24表达的主要影响因素，具有显著性差异；诱导时间、培养基pH值和诱导剂IPTG浓度对蛋白表达的影响较小，无显著差异。综合分析，42℃诱导4 h，培养基pH值为7.0，IPTG浓度为0.12 mmol/L，是CSP-MDA-7/IL-24蛋白表达的最佳条件。背景清楚等优点的原核表达系统进行表达。原核系统表达时，不同诱导条件在很大程度上影响目的蛋白的表达量。本实验中，融合基因CSP-MDA-7/IL-24在大肠杆菌BL21/pET21b表达
表1正交实验选取因素及其水平
图6 SDS-PAGE分析正交试验各条件下目的蛋白的表达量
表2正交试验结果
表3正交试验软件方差分析各因素对目的蛋白表达量的影响
3讨论
蛋白质药物凭借其活性高、特异性强、毒性低、生物功能明确和有利于临床应用等特点，已经成为医药领域的重要组成部分。重组蛋白可通过原核表达系统、昆虫表达系统和酵母系统等进行表达。在本实验中，我们利用DNA重组技术构建融合基因CSP-MDA-7/IL-24，选取具有易于培养、繁殖快、表达量高、成本低、易纯化和遗传载体中被诱导表达，蛋白产物以包涵体的形式存在，有利于目的蛋白的进一步提纯。
研究表明，细菌生长速率对外源蛋白表达有很大影响。为提高目的蛋白表达效率，我们通过测定重组菌株的生长曲线，确定最佳诱导时机。单因素分析确定最适培养基pH值、最佳诱导温度、最佳诱导时间和最适诱导剂IPTG浓度，并在此基础上各选取5个水平进行正交试验，摸索出最佳诱导表达条件。单因素分析结果表明，在最佳诱导时机，随着诱导时间不断增加，目的蛋白表达量也在不断增加，诱导4 h时达到浓度高峰。在相同诱导时间下，SDS-PAGE结果分析表明，培养基pH为7.0、诱导温度42℃、不同IPTG浓度下表达量相当。正交试验SDS-PAGE结果表明，CSP-MDA-7/IL-24重组蛋白的表达最佳条件组合为诱导4 h、pH7.0、诱导温度42℃、IPTG浓度0.12 mmol/L，此时目的蛋白表达量最高，达43.6%。正交分析结果表明，四因素五水平中，诱导温度对重组蛋白表达具有显著性影响，而pH值、温度和IPTG浓度则无明显影响。
本研究确定了重组蛋白肝靶向肽-抗肿瘤肽的最佳表达条件，为深入探讨其复性条件、纯化条件、生物学活性及药物开发等提供了更多实验依据。