2.3流式细胞术检测人参外泌体对RAW264.7细胞极化的影响
人参外泌体作用于RAW264.7细胞后，使用流式细胞术检测M1型巨噬细胞分子标志CD80的表达，实验结果表明（图3），与空白对照组相比，经过不同浓度的人参外泌体处理后，M1型巨噬细胞分子标志CD80显著升高（P<0.05），且具有浓度依赖性，浓度为20µg/mL时，M1型型巨噬细胞分子标志CD80上调最为显著（P<0.01），浓度为10µg/mL时次之。这表明人参外泌体可以有效的刺激巨噬细胞向M1方向极化。
图3流式细胞术检测人参外泌体对RAW264.7细胞极化的影响
注：与空白对照组相比，*P<0.05，**P<0.001。
2.4人参外泌体刺激巨噬细胞M1极化对A549细胞活力的影响
A549细胞与条件培养基共培养后，使用CCK-8检测A549细胞的活性，实验结果表明（图4），与空白对照组相比，LPS组A549细胞活力受到抑制（P<0.001）；与空白对照组相比，随着人参外泌体给药浓度的增加，A549细胞活力呈梯度下降，人参外泌体浓度为20μg·mL−1时，A549细胞的细胞活力最低（P<0.001），其次是人参外泌体浓度为10μg·mL−1（P<0.001），人参外泌体浓度为5μg·mL−1（P<0.001）时抑制能力最弱；这表明人参外泌体可以显著抑制A549细胞的生长，减弱肿瘤细胞A549的增殖能力。
图4人参外泌体刺激巨噬细胞M1极化对A549细胞活力的影响
注：与空白对照组相比，***P<0.001。
2.5人参外泌体刺激巨噬细胞极化对A549细胞周期的影响
肿瘤细胞的快速增殖与细胞周期的进程密切相关，调控肿瘤细胞的细胞周期，促进其快速凋亡是目前肿瘤治疗的重要研究方向[26]，细胞周期一般分为G0、G1、S、G2和M期，主要受c-myc、cyclin A、cyclin D1等基因调控[27]，主要细胞分裂过程中发生的细胞周期停滞引起的损伤和错误很难修复[28]。通过流式细胞仪检测A549细胞的细胞周期，实验结果表明（图5），与空白对照组相比，LPS组A549细胞的G1期细胞数目增多（P<0.01），S期细胞数目减少；与空白对照组相比，人参外泌体中剂量组与人参外泌体高剂量A549细胞处于G1期细胞数目增多（P<0.05），S期的细胞数目显著减少（P<0.05）。这意味着人参外泌体在G1期阻断了A549细胞的细胞周期，从而阻止了DNA的正常复制，抑制了肿瘤的生长。
图5人参外泌体刺激巨噬细胞极化对A549细胞周期的影响
注：与空白对照组相比，*P<0.05，**P<0.01。
2.6人参外泌体刺激巨噬细胞极化对A549细胞凋亡的影响
细胞周期进程被阻滞后，将会进一步导致细胞凋亡，凋亡是通过激活内在自杀机制而诱发的细胞程序性死亡过程。采用流式细胞仪检测人参外泌体刺激巨噬细胞M1极化对A549细胞凋亡的影响（图6），与空白对照组相比，LPS组凋亡的细胞比例显著升高（P<0.01）；与空白对照组相比，人参外泌体给药组细胞凋亡的比例显著升高，人参外泌体的浓度为10μg·mL−1凋亡的细胞比例最高（P<0.01），其次是人参外泌体浓度为20μg·mL−1，人参外泌体浓度为5μg·mL−1凋亡的细胞比例最低（P<0.01）。这表明人参外泌体通过刺激巨噬细胞M1极化从而有效地诱导了A549细胞的凋亡。
图6人参外泌体刺激巨噬细胞极化对A549细胞凋亡的影响
注：与空白对照组相比，**P<0.01。
2.7人参外泌体通过激活TLR4/MyD88信号通路促进A549细胞凋亡
TLR4信号可以通过MyD88和TRIF途径传递。MyD88通路通过募集IL-1受体相关激酶（IRAK-κ）诱导NF-κB的早期激活。IRAK蛋白与TNF受体相关因子6（TRAF6）相互作用并激活。TRAF6招募并激活TAK1。TAK1激活了核因子κB激酶（IKK），然后NF-κB结合抑制蛋白IκB被IKK磷酸化，随后泛素化和降解，导致NF-κB的二聚体p65-p50失去抑制作用，然后发挥其转录因子的作用，进入细胞核驱动炎性胞质分裂的转录基因。NF-κB作为一种转录因子，与机体的炎症反应密切相关，NF-κB的活化将导致iNOS、COX-2蛋白表达增加。为了进一步明确人参外泌体刺激巨噬细胞极化抑制A549细胞增殖的内在机制，采用Western blot检测A549细胞中TLR4、MyD88、NF-κB、iNOS、COX-2蛋白的表达，结果显示（图7），与空白对照组相比，LPS组和不同剂量的人参外泌体给药组TLR4、MyD88、NF-κB、iNOS、COX-2蛋白表达均增加。其中NF-κB的表达具有明显的浓度依赖性，与空白对照组相比，人参外泌体高剂量组NF-κB的表达最高（P<0.01），中剂量组次之（P<0.01），低剂量组NF-κB的表达最低（P<0.01）。
图7人参外泌体刺激巨噬细胞M1极化对A549细胞TLR4/MyD88通路相关蛋白表达的影响
注：与空白对照组相比，*P<0.05，**P<0.01。
3.结论
本次实验模拟肿瘤微环境，收集LPS和人参外泌体处理的RAW264.7细胞衍生的上清液，制成CM并与A549共培养，首次证实了人参外泌体促进巨噬细胞向M1极化，激活TLR4/MyD88/NF-κB信号通路促进炎症因子的表达水平，显著抑制A549细胞增殖，调节A549细胞周期，从而诱导A549细胞凋亡，发挥抗肿瘤作用。此外，本研究对人参外泌体在非小细胞肺癌（NSCLC）相关疾病的治疗领域奠定了实验基础，并为进一步探索人参外泌体在TLR4/MyD88/NF-κB信号通路方面的相关研究提供了理论支持。但人参外泌体促进巨噬细胞M1极化后M1型巨噬细胞所占比例尚不明确，我们将继续深入研究M1型巨噬细胞与A549细胞之间相互作用的具体机制。