1.4.3不同培养条件下的生长曲线的测定
取纯化后的细菌液体培养，菌液浓度达到1×108~5×108CFU/mL。取200μL的菌液和20 mL添加5%牛血清的THB液体培养基于锥形瓶中，在不同培养温度（25、37、42℃）、培养基pH值（4~9）、盐浓度（1%~5%）条件下测定0、2、4、6、8、10、12、14 h菌液OD600nm值，绘制生长曲线。
1.4.4常用消毒剂中和剂的筛选
将0.5%碘伏的中和剂设为0.5%硫代硫酸钠+1%卵磷脂+1%吐温80和0.5%硫代硫酸钠+1%卵磷脂+3%吐温80；0.2%新洁尔灭中和剂设为1%卵磷脂+1%吐温80和1%卵磷脂+2%吐温80；1 000 mg/L的84消毒液中和剂设为5%硫代硫酸钠+1%卵磷脂+1%吐温80和1%硫代硫酸钠+2%卵磷脂+3%吐温80；5%来苏水中和剂设为3%吐温80[16]。参照《消毒技术规范》[17]，设置6个试验组，分别为：消毒剂+菌悬液、消毒剂+菌悬液、中和剂+菌悬液、消毒剂+中和剂+菌液、稀释液+菌悬液（阳性对照）、稀释液+中和剂+培养基（阴性对照）。试验结果需符合第1组无菌生长，或仅有极少数分离株菌落生长；第2组有菌落生长，且较第1组为多，但较第3，4，5组少；第3~5组有相似量试验菌生长，其组间菌落数误差率应不超过15%；第6组无菌生长[18]。
1.4.5常用消毒剂对驴源马链球菌马亚种杀菌率的检测
取0.5 mL菌悬液、0.5 mL 3%牛血清白蛋白加入试管，混匀，置20℃水浴5 min后，加入不同浓度消毒液4.0 mL注入其中，迅速混匀并立即计时。至各预定时间后分别吸取0.5 mL混合液加于4.5 mL中和剂，混匀。作用10 min后，吸取1.0 mL混合液，按平板计数方法测定存活菌数，每管混合液接种2个培养基。阳性对照组用稀释液代替消毒剂溶液，所得结果代表菌液原有浓度。消毒剂试验设计见表1。消毒剂杀菌率的计算公式如下：
表1消毒剂试验分组
2结果与分析
2.1病原菌分离纯化及生化特性
从发病驴和死亡驴的下颌脓汁和死亡驴肺部脓汁共分离到4株菌，XJ201901为死亡驴下颌脓汁分离，XJ201902为死亡驴肺部分离，XJ201903和XJ201904为发病驴下颌脓汁分离。
由图1可知，4株菌均为革兰氏阳性，长链状球菌，β溶血。
图1分离菌镜检及血平板培养情况
由表2可知，4株分离菌生化鉴定结果均为马链球菌马亚种，置信度94%。
表2分离株生化鉴定结果
2.2 PCR鉴定结果
图2 seM基因PCR鉴定
4株分离菌提取基因组DNA后，用seM基因特异性引物扩增seM基因片段。由图2可知，扩增产物经核酸电泳后可观察到1条长约542 bp的片段，经过测序对比分析，结果显示其序列与NCBI中登录的驴源马链球菌马亚种seM基因序列（MH973488.1）同源性均超过99%，说明4株分离菌株均为马链球菌马亚种。
2.3分离菌株不同培养条件下的生长特性（见图3~图5）
由图3可知，4株分离菌在不同温度下生长情况明显不同，37℃条件下细菌生长迅速，4 h进入对数期并在8 h达到高峰，菌量可达108CFU/mL，8~14 h基本处于平台期。25℃条件下细菌生长缓慢，培养10 h后才有明显生长。42℃条件下，分离株比37℃早一步进入对数期，在6 h达到高峰，但总菌量低于37℃，平台期维持时间较短，8 h之后快速进入衰亡期。
图3不同温度条件下4株分离菌生长曲线
由图4可知，4株分离菌在4%及5%盐浓度时不生长。1%和2%盐浓度4 h进入对数期，8~12 h处于平台期，12 h后细菌开始衰亡，生长趋势一致，但是2%盐浓度下细菌总量低于1%盐浓度3%盐浓度条件下细菌生长缓慢12~14 h才达到其最大值。
图4不同盐浓度条件下4株分离菌生长曲线
由图5可知，4株分离菌在pH值为4、5、9时不生长；pH值为7、8时，细菌生长情况基本一致；但pH值为8条件下，细菌在衰亡期的下降要快于pH值为7的条件；pH值为6时，细菌生长缓慢，菌量始终显著低于pH值7、8。
图5不同pH值条件下4株分离菌生长曲线
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