1.2培养基


人工海水(%,w/v):NaCl 2.5,MgSO40.5,KCl 0.1,CaCl20.02,K2HPO40.01,FeSO40.002;牛肉膏蛋白胨培养基(%,w/v):蛋白胨1,牛肉膏0.3,琼脂粉1.5,NaCl 0.5,pH7.2~7.6;初筛培养基:2216 E固体培养基;复筛培养基(%,w/v):琼脂粉0.2,酵母浸出粉0.3,人工海水配制,pH7.2~7.6;斜面培养基:同初筛培养基


1.3菌株的筛选


取样地点是青岛红岛近海海域。取近海沉积物于无菌密封袋中,常温保存。取沉积物样品5 g于45 mL无菌水中,振荡摇匀。将稀释10-1~10-5五个浓度梯度的样液分别涂布在牛肉膏蛋白胨平板培养基中,30℃培养1~2 d,挑取透明圈或凹陷较大的菌落点接于初筛平板培养基,并做好标记,在30℃下培养1~2 d后用卢戈氏碘液进行染色,挑选透明圈与菌落的直径比值大的菌落,并根据标记挑取原菌落于初筛培养基上进行划线培养1~2 d,挑取单菌落于复筛液体培养基中,30℃,150 r/min发酵培养1~2 d,测发酵液的酶活力,筛选出酶活力较高的菌株,并进行斜面和甘油管保藏。


1.4琼胶酶活力测定


于25 mL比色管中加入0.5 mL经4℃6000 r/min离心10 min的发酵上清液和1.5 mL含0.5%琼脂的磷酸盐缓冲液(pH7.0),置于50℃水浴保温15~20 min后取出,加入1.0 mL DNS试剂终止酶解反应,沸水浴显色5 min,冷却后定容至25 mL,充分摇匀后于5000 r/min离心10 min,取适量上清液在520 nm处测吸光值,将酶液煮沸灭活后同此法处理作为对照。根据标准曲线算出上清液中的还原糖含量。酶活力单位定义为在上述条件下,1 min转化生成1μg还原糖所需酶的量为一个酶活力单位(U/mL)。


1.5菌体生长和产酶曲线的测定


以3%的接种量将种子液接种到发酵培养基,150 r/min,30℃摇床发酵培养,每2 h取适量发酵液测生物量及酶活力,绘制生长曲线和产酶曲线。


1.6菌种形态学鉴定


观察菌落在平板上的形态并对其进行卢戈氏染色、革兰氏染色并镜检观察菌体形态等。


1.7系统发育树的构建


CTAB法提取菌株基因组DNA,将收集得到的DNA为模板,引物采用通用引物27F(5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′)和1492R(5′-GGCTA CCTTGTTACGACTT-3′)。PCR扩增程序为95℃2 min;94℃30 s,55℃30 s,72℃1 min,35个循环;72℃10 min。将PCR产物琼脂糖凝胶电泳检测,送至上海生工生物工程有限公司测序。利用BLAST程序在GenBank上对结果进行相似性比对,使用MEGA6.0的Neighbor-Joining(NJ)方法构建系统发育进化树。


1.8酶学性质研究


最适温度的测定:在20~70℃下测定酶活力,其中底物浓度0.5%、反应体系pH7.0;最适pH的测定:在pH4.0~9.0下测定酶活力,其中酶解温度是45℃、底物浓度为0.5%;最适底物浓度的测定:在底物浓度0.1%~1.0%下测定酶活力,其中酶解温度45℃、反应体系pH7.0;金属离子对酶解反应的影响:将琼胶酶酶液中分别加入Mn2+(MnCl2)、Ca2+(CaCl2)、Ba2+(BaCl2)、Na+(NaCl)、K+(KCl)、Mg2+(MgCl2)、Fe2+(FeCl2)使酶溶液含有5 mmol/L的金属离子,4℃放置10 min后测定酶活力。以上实验做三次平行,结果取平均值。


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