摘要［目的］篩选可培养功能微生物，为农业废弃物的循环利用提供微生物资源。［方法］以喂食废菌渣的白星花金龟幼虫虫粪为研究对象，采用平板涂布法分离虫粪中的可培养微生物，并对其分解纤维素和蛋白质能力进行初步探究。［结果］共分离出细菌5株、真菌3株，经鉴定，分别为纤维化纤维微细菌、铅黄肠球菌、原玻璃蝇节杆菌、谷氨酸杆菌、灰色链霉菌、热带假丝酵母、长枝木霉和白地霉。其中纤维化纤维微细菌和灰色链霉菌具有降解蛋白质的能力，在酪蛋白培养基上透明圈直径与菌落直径的比值（HC）分别为7.259±0.417和1.971±0.584；原玻璃蝇节杆菌、灰色链霉菌、白地霉、长枝木霉具有降解纤维素的能力，在羧甲基纤维素钠上经刚果红染色后透明圈HC分别为1.166±0.028、2.044±0.245、1.075±0.029、1.288±0.048。［结论］纤维化纤维微细菌、原玻璃蝇节杆菌、灰色链霉菌、白地霉和长枝木霉可作为食用菌废菌渣等农业废弃物循环利用的菌种资源。
白星花金龟（Protaetia brevitarsis），属鞘翅目花金龟科，是一种宝贵的昆虫资源，在药用、饲用、生态等方面均具有较高的利用价值。研究表明，白星花金龟幼虫多在腐殖质丰富的土壤或粪堆中生活，以腐烂的秸秆、杂草以及禽畜粪便为食［1］，其幼虫在对秸秆进行转化的同时，也可以获得虫体和虫粪等副产品，极具有开发利用价值。白星花金龟幼虫对平菇菌糠、猪粪、牛粪、玉米秸秆等农业有机废弃物消化率较高［2］。对东亚飞蝗粪沙、玉米秸秆、小麦秸秆和花生壳均有一定的转化作用［3］，且获得的幼虫干物质中蛋白质、脂肪和氨基酸含量较高［4］，虫粪沙也富含较多的有机物质［5］。因此，在利用白星花金龟幼虫转化利用农业有机废弃物的同时，不仅治理了环境问题，还提高了虫体和虫粪沙资源的利用率。
目前有关白星花金龟幼虫在废弃物循环利用方面的研究主要集中在幼虫对农业废弃物的转化利用、农业有机废弃物对幼虫生物学特性影响、幼虫肠道微生物筛选以及幼虫虫粪有机肥等方面，而对于幼虫虫粪微生物的筛选及多样性研究鲜见报道。黄婉秋等［6］从白星花金龟幼虫肠道中分离出1株具有较强纤维素降解能力的纤维单胞菌，其CMC酶活性峰值能达0.19 U/mL，并确定该菌株具有包括内切葡聚糖酶、β-葡聚糖苷酶和外切葡聚糖酶等纤维素降解相关基因及代谢通路。赖德强等［7］将白星花金龟幼虫虫粪按比例添加在辣椒育苗基质中，结果发现，辣椒幼苗的生物量、根系发育情况以及壮苗指数均显著高于对照组，提高了辣椒苗期的耐寒能力。刘福顺等［8］研究施用不同量白星花金龟幼虫虫粪对樱桃萝卜生长情况的影响，结果显示，在一定范围内随着虫粪施用量的增加，樱桃萝卜地上部、地下部鲜质量均呈现增加的趋势。该研究以饲喂食用菌废菌渣的白星花金龟幼虫为研究对象，收集其新鲜虫粪后采用平板涂布法分离其中的可培养微生物，为筛选可高效利用的微生物提供菌种资源和基础数据。
1材料与方法
1.1试验材料白星花金龟幼虫由河北燕塞生物科技有限公司提供，主要以食用菌废菌渣为食。
1.2培养基
LB培养基：广东环凯微生物科技有限公司；PDA培养基：马铃薯20 g，葡萄糖20 g，琼脂20 g，蒸馏水1 000 mL；麦芽汁培养基：青岛海博生物技术有限公司；酪蛋白培养基：酪蛋白10.00 g，牛肉浸粉3.00 g，氯化钠5.00 g，磷酸氢二钠2.00 g，琼脂15.00 g，溴麝香草酚蓝0.05 g，pH 7.4±0.1；羧甲基纤维素钠培养基：羧甲基纤维素钠15.0 g，硝酸铵1.0 g，酵母膏1.0 g，硫酸镁0.5 g，磷酸二氢钾1.0 g，琼脂20.0 g，蒸馏水1 000 mL，pH自然；赫奇逊氏无机盐培养液：KH2PO4 1.00 g，NaCl 0.10 g，MgSO4·7H2O 0.30 g，NaNO3 2.50 g，FeCl3 0.01 g，CaCl2 0.10 g，蒸馏水1 000 mL，pH 7.2左右；液体产酶培养基：玉米秸秆粉20 g，赫奇逊氏无机盐培养液1 000 mL。
1.3试验方法
1.3.1微生物的分离纯化。
收集新鲜的幼虫粪沙0.1 g于无菌管中，加入0.9 mL无菌水充分混匀后，稀释至10-2、10-3浓度梯度涂布于分离培养基上，于30℃恒温培养箱中培养，待长出菌落后，挑取单菌落至相应的培养基上进行划线培养，纯化次数3次以上，直至获得稳定生长的单菌落。
1.3.2形态学鉴定。菌落形态观察：将获得的菌株挑取单菌落进行平板划线培养，观察菌体在培养基上的菌落形态及生长情况。菌体形态观察：染色后置于显微镜下观察菌体形态。
1.3.3分子生物学鉴定。
1.3.3.1DNA提取。分别用Ezup柱式细菌、真菌、酵母菌基因组DNA抽提试剂盒提取相应微生物的基因组DNA。
1.3.3.2PCR扩增及测序。采用通用引物进行PCR扩增，其中，细菌引物序列27F（AGAGTTTGATCMTGGCTCAG）、1492R（GGTTACCTTGTTACGACTT）；酵母菌引物序列NL1（GCATATCAATAAGCGGAGGAAAAG）、NL4（GGTCCGTGTTTCAAGACGG）；真菌引物序列ITS1（TCCGTAGGTGAACCTGCGG）、ITS4（TCCTCCGCTTATTGATATGC）。扩增产物送至生工生物工程（上海）股份有限公司测序。
1.3.4降解蛋白质和纤维素能力初探。
将分离纯化的菌株分别点接种至酪蛋白固体培养基上，培養后观察菌株生长情况及产生透明圈情况，并计算透明圈直径与菌落直径的比值（HC），探究各菌株降解蛋白质的能力。
将分离纯化的菌株分别点接种至羧甲基纤维素钠固体培养基上，培养后观察菌株生长情况，用刚果红染色后观察透明圈情况，计算透明圈HC值，探究各菌株降解纤维素的能力。