1材料与方法
1.1材料
1.1.1试验菌株和质粒大肠杆菌AN102、ATCC25922由畜禽疫病防控技术北京市重点实验室保存;人源空肠弯曲菌参考菌株NCTC11168由中国疾病预防控制中心传染病预防控制所惠赠;30株鸡肠道临床大肠杆菌菌株分离自2020—2023年北京郊区多个养鸡场泄殖腔拭子样品;λRed重组系统所用质粒pKD3、pKD46、pCP20由扬州大学兽医学院惠赠。
1.1.2主要试剂及仪器细菌培养基
购自ThermoFisherScientific公司;DpnⅠ限制性内切酶购自New EnglandBiolabs公司;分子生物学试剂盒和PCR试剂均购自南京诺唯赞生物科技股份有限公司;肠菌素纯品、氨苄青霉素、氯霉素、L-阿拉伯糖均购自Sigma-Aldrich公司;ELISA用试剂包被液、终止液、显色液均购自北京索莱宝科技有限公司;辣根过氧化物酶(HRP)标记的山羊抗小鼠IgG购自Abcam公司。MicroPulser Electroporator电击仪(GenePluserXcell)和凝胶成像仪(GelDocTM XR+)均购自Bio-Rad公司;MastercyclernexusPCR仪和台式离心机(5840R)购自Eppendorf公司;Heracell三气培养箱、NanoDrop2000核酸测定仪购自ThermoFisherScientific公司;BioScreenerC全自动生长曲线分析仪购自OyGrowthCurvesAbLtd公司;SynergyH1多功能酶标测定仪购自Bio-Tek公司。
1.2方法
1.2.1大肠杆菌肠菌素样品制备
用LB肉汤分别培养30株鸡肠道临床大肠杆菌分离株，配制T-medium培养液，8000r/min离心2min收集菌体后用T-medium培养液重复洗涤2次，将菌液D600nm值调为1.0后按照1∶100比例接种新鲜T-medium培养液，37℃振摇培养24h后收集菌液，经5000r/min离心3min后收集培养上清液，用于后续测定肠菌素浓度。
1.2.2间接竞争ELISA(ic-ELISA)检测肠菌素含量
研究报道，利用ic-ELISA方法检测培养上清中肠菌素含量。用包被液稀释包被抗原Ent-BSA(终浓度为1ng/μL)，加入96孔酶标板中，每孔100μL，置4℃孵育过夜，经洗涤封闭后，加入不同浓度的肠菌素和待测细菌培养上清液样品50μL，再加入稀释后的肠菌素单抗(1∶256000稀释)孵育2h，经洗涤后加入100μL稀释后的HRP标记的山羊抗小鼠IgG(1∶8000)，37℃孵育1h，洗涤后每孔加入100μLTMB单组份显色液，避光显色15min后加入50μL终止液，每个样品做2个平行孔，试验重复3次，利用多功能酶标测定仪测D450nm和D630nm值，计算每个样品的D值(D=D450nm―D630nm)，利用肠菌素纯品绘制标准曲线，计算肠菌素含量。
1.2.3引物设计
参照GenBank中大肠杆菌基因组(登录号:NC_000913.3)信息，以及pKD3质粒序列，使用PrimerPremier5.0软件设计菌株鉴定引物EC-F/R和entB基因缺失引物EC-F1/R1，以及λRed重组系统质粒验证引物，引物序列见表1，引物均由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。
表1引物信息
1.2.4 entB基因缺失株的构建及鉴定
利用λRed同源重组系统构建大肠杆菌entB基因缺失突变株，如图1所示。以pKD3质粒DNA为模板，通过引物EC-F1/R1进行PCR扩增获得两端为entB基因的同源臂序列，中间为氯霉素(Cm)抗性基因片段，扩增产物用DpnⅠ进行酶切，以消除PCR产物中质粒DNA的污染，切胶回收后获得打靶替换entB基因的抗性基因DNA，经核酸测定仪定量后保存备用。
图1λRed重组系统构建大肠杆菌entB基因缺失突变株示意图
利用氯化钙法将pKD46质粒DNA导入拟突变的大肠杆菌菌株中，在含100μg/mL氨苄青霉素(Amp)的LB固体培养基上筛选获得阳性克隆，使用引物pKD46-F/R对阳性克隆进行PCR验证。在添加Amp的LB肉汤中30℃振摇培养至D600nm值为0.3，加入L-阿拉伯糖(15 mmol/L)诱导，促进λRed重组酶表达，利用10%甘油水洗涤后制备电转用感受态细胞，加入打靶用抗性基因DNA进行电转化(1.8kV、200Ω、25μF)，在含25μg/mLCm的LB固体培养基上筛选阳性克隆，利用鉴定引物EC-F/R对阳性克隆进行PCR鉴定并测序，获得对Amp敏感而对Cm抗性的阳性菌株ΔentB∷Cm(Mu1)，保种后备用。利用Mu1菌株制备感受态细胞，将pCP20质粒DNA经电转化导入，挑选阳性克隆至含Cm和Amp的LB固体培养基中30℃培养，使用引物pCP20-F/R对阳性克隆进行PCR验证，将阳性克隆传代至无抗LB液体培养基后30℃振摇培养2h，再将温度调至37℃培养，涂布于无抗LB固体培养基中37℃培养，挑取单菌落筛选出对Amp和Cm均敏感的菌株ΔentB(Mu2)，保种后备用。
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