2.4 entB基因缺失株在富铁和限铁培养基中生长能力的比较
利用富铁培养基LB和限铁培养基T-medium分别培养大肠杆菌亲本株和突变株，鉴定entB基因缺失对细菌摄取铁促进生长的影响，结果显示，大肠杆菌AN102和ATCC25922亲本株在LB培养基中正常生长，2h后开始进入对数生长期，平台期D600nm值达到1.0左右;突变株Mu1、Mu2与亲本株生长曲线趋势一致(图6A、6B)。在T-medium培养基中约4h进入对数生长期，平台期D600nm值达到0.6左右;突变株Mu1和Mu2没有明显的对数生长期，平台期D600nm值比亲本株降低约0.3(图6C、6D)。
A、B，大肠杆菌AN102和ATCC25922亲本株、突变株在LB培养基中生长曲线;C、D，大肠杆菌AN102和ATCC25922亲本株、突变株在T-medium培养基中生长曲线
图6大肠杆菌entB基因缺失株在富铁和限铁培养基中生长曲线
2.5大肠杆菌肠菌素对空肠弯曲菌的影响促生长试验结果显示，大肠杆菌AN102培养上清孔周围出现明显的生长圈，而大肠杆菌AN102的突变株Mu1、Mu2培养上清孔周围未见生长圈(图7)。
将大肠杆菌培养上清液与T-medium以1∶1比例混合后接种空肠弯曲菌，通过菌落计数判定菌株的生长情况。结果显示，接种后0和12h，各组菌株生长无显著差异(P大于0.05)，菌落计数分别约为6.5和7.0lgCFU/mL;接种后24和36h，大肠杆菌AN102亲本株培养上清中的空肠弯曲菌菌落数极显著高于其他组(P小于0.01)，分别为7.8和8.2lgCFU/mL，而其他组约为7.0和7.3lgCFU/mL(图8)。
图7大肠杆菌肠菌素对空肠弯曲菌生长作用效果检测
①A~D，培养时间分别为0、12、24和36h。②*，差异显著(P小于0.05);**，差异极显著(P小于0.01);无*，差异不显著(P大于0.05)
图8不同培养时间空肠弯曲菌菌落计数结果
3讨论
目前关于肠菌素的检测有多种方法，Schwyn等利用铁载体对三价铁有高度亲和力的特性，开发了一种使用CAS和HDTMA作为指示剂的铁载体测定法，此法偏向于对铁载体定性检测，无法测定肠菌素准确浓度;Uranga等利用串联液相色谱-质谱仪(LC-MS/MS)、高效液相色谱(HPLC)和核磁共振光谱(NMR)测定肠菌素的浓度，但操作繁琐且需特殊仪器;Cui等基于肠菌素单抗建立了一种定量检测肠菌素的ic-ELISA方法，操作简便快速，测定大肠杆菌分泌肠菌素的浓度可达417.3μg/mL。本试验利用ic-ELISA方法对鸡肠道分离的大肠杆菌肠菌素进行检测，培养上清中肠菌素浓度介于11~126μmol/L之间，表明不同来源的大肠杆菌分泌肠菌素能力存在差异。
细菌基因敲除技术主要包括λRed重组系统介导的同源重组、自杀载体介导的同源重组、Cas9切口酶介导的CRISPR、转座子介导的基因插入失活和RNA干扰技术等，目前λRed重组技术在大肠杆菌等肠杆菌科细菌基因突变中应用成功率较高。前期利用自杀载体介导的同源重组技术构建突变株，但突变效率较低，改用λRed同源重组技术后短时间内成功构建2株大肠杆菌entB基因缺失突变株，证实该技术适用于大肠杆菌的基因突变操作。
肠菌素介导的铁调节系统由肠菌素合成、分泌、利用等一系列基因组成，其中entB是肠菌素合成过程中的一个关键基因。沙门菌entB基因缺失突变后不但丧失合成肠菌素的能力，而且在巨噬细胞中的存活能力显著降低;在炎症性肠道内，人源多形拟杆菌可利用大肠杆菌分泌的肠菌素，但entB基因缺失突变后，多形拟杆菌在肠道内的恢复能力显著降低。本试验构建的2株大肠杆菌entB基因缺失突变株均丧失了合成肠菌素的能力，在富铁培养基中生长性能不受影响，但在缺铁培养基中生长能力显著降低，表明在限铁培养条件下肠菌素能够促进大肠杆菌的生长。由于宿主体内是一个缺铁的环境，推测肠菌素介导的铁调节系统在细菌生长和定植宿主过程中发挥重要作用。
宿主肠道内不同微生物之间存在合作和竞争的关系，肠菌素在微生物相互作用过程中不仅作为铁载体，而且作为一种信号分子，调节不同菌群在肠道内的定植。研究显示，肠道内共生大肠杆菌分泌肠菌素竞争铁，可抑制病原沙门菌在肠道内的定植，而丧失肠菌素分泌能力的大肠杆菌无法抑制沙门菌的定植;除肠杆菌科细菌外，人源多形拟杆菌自身也不能分泌肠菌素，但可利用肠杆菌科细菌分泌的肠菌素促进其生长和定植，是宿主肠道内的一种常见的共生菌。由于空肠弯曲菌自身不能合成肠菌素，本研究结果显示，空肠弯曲菌可利用大肠杆菌分泌的肠菌素促进其在缺铁环境中生长，为空肠弯曲菌利用异源肠菌素提供了试验依据，但在宿主体内空肠弯曲菌如何利用大肠杆菌分泌的肠菌素来促进其定植和感染，尚需进一步深入探究。
4结论
本试验中30株鸡肠道大肠杆菌分离株均可分泌肠菌素，大肠杆菌entB基因缺失突变后不能分泌肠菌素，在限铁环境中的生长能力显著降低，且大肠杆菌肠菌素在限铁环境中能促进空肠弯曲菌的生长，结果为深入研究肠菌素介导的肠道细菌之间的相互作用奠定了基础。