随着水貂养殖业的发展,养殖规模也在不断扩大,水貂经过多年的人工驯化,长期处于不良饲养环境下,导致其抗病能力出现大幅度降低,一旦发病就会造成巨大的经济损失,这也是制约水貂养殖业发展的重要因素。绿脓杆菌又称为铜绿假单胞菌,广泛存在于自然界中,能够引起水貂出血性肺炎,严重危害水貂养殖业。绿脓杆菌普遍存在较强耐药性,据报道其对第三代头孢菌素等的耐药率高达60%,急需开发新的抗生素替代品,用于绿脓杆菌病的防治。
噬菌体是一种能够特异性侵染细菌的病毒,在自然界中广泛存在,影响着细菌的生态及进化。根据噬菌体侵入和裂解细菌的特点,可将噬菌体分为溶源性噬菌体和烈性噬菌体。烈性噬菌体通过识别宿主菌细胞表面受体吸附于细菌表面,进而快速裂解细菌,具有种属特异性强、不影响正常菌群、不受细菌耐药性影响的优点,具有作为抗生素替代品的潜在开发优势。近年来,烈性噬菌体广泛应用于食品消毒和细菌病的预防和治疗。
本试验用双层平板法分离得到了1株绿脓杆菌噬菌体,测定了该噬菌体的形态和生物学特性,为进一步开发噬菌体制剂防治水貂绿脓杆菌病提供依据。
1材料与方法
1.1材料27株绿脓杆菌临床分离株由青岛农业大学微生物实验室保存。水貂粪便样本采集自青岛市胶州水貂养殖场。
1.2方法
1.2.1噬菌体的分离与纯化
水貂粪样加入500 mL LB肉汤和27株绿脓杆菌新鲜菌液各500μL混匀,37℃过夜培养,增殖噬菌体。样品经过滤、离心、抽滤后,各取100μL滤液分别加入等量27株绿脓杆菌菌液,双层平板法分离噬菌体。用单斑法纯化分离到的噬菌体。
1.2.2噬菌体的电镜观察参
取噬菌体增殖液滴于铜网上,2%磷钨酸(PTA)染色,干燥后,透射电子显微镜观察噬菌体形态。
1.2.3噬菌体裂解谱的测定
根据点样法测定噬菌体的裂解谱。分别将27株绿脓杆菌增殖液200μL均匀涂布于普通培养基平板,滴加噬菌体增殖液于平板,于37℃恒温培养箱中倒置培养6 h。
1.2.4噬菌体效价测定
将噬菌体增殖液10倍比稀释后,取100μL各稀释度的增殖液分别与等量的菌液混匀,用双层平板法进行噬菌体效价的测定。
1.2.5噬菌体对温度、pH值敏感性的测定
噬菌体增殖液分别加入不同pH值(2～13)的LB肉汤,37℃水浴分别作用1、2 h和3 h,立即测定噬菌体效价,绘制噬菌体phage30的pH值稳定性曲线。100μL的噬菌体增殖液分别在40℃、50℃、60℃、70℃和80℃水浴中作用20、40 min和60 min,立即测定噬菌体效价,绘制噬菌体phage30的热稳定性曲线。
1.2.6噬菌体最佳感染复数测定
对噬菌体增殖液和对数期的宿主菌菌液进行计数。分别按照感染复数为0.001、0.01、0.1、1、10和100的比例混匀至LB肉汤中,37℃振荡培养至摇清,双层平板法测定噬菌体效价。
1.2.7噬菌体一步生长曲线测定
参照Zhang C等报道测定噬菌体一步生长曲线,方法略有改动。按最佳感染复数比例混匀噬菌体增殖液和宿主菌菌液,37℃孵育5 min,13 000 r/min离心30 s,LB肉汤重复洗涤两次,弃上清。用LB肉汤重悬沉淀,37℃震荡培养。在不同的时间点取200μL的增殖液,16 000 r/min离心1 min,测噬菌体效价。绘制一步生长曲线。