2.4噬菌体全基因组分析
2.4.1噬菌体PC79-13的进化分析
噬菌体PC79-13基因组序列全长为86 886 bp(GenBank登录号为OR687644.2)，在其基因组中未发现mcr-1(黏菌素耐药基因)，qnr(喹诺酮类耐药基因)，sul1、sul2、sul3(磺胺类耐药基因)，floR(氯霉素抗性基因)，同时不含有过敏原相关基因，因此在生物安全上不存在隐患。根据NCBI数据库BLAST核苷酸序列比对结果，噬菌体PC79-13的基因组DNA与大肠杆菌噬菌体SUSP2的基因组DNA高度相似(相似性96.67%，覆盖率94%，登录号NC 028935.2)，同时与大肠杆菌噬菌体CHB7的基因组DNA相似度也较高(相似性96.65%，覆盖率91%，登录号MK562504.1)。基于全基因组进化树分析比对(图7)可知噬菌体PC79-13与大肠杆菌SUSP2亲缘性最高，属于同一分支，即双链DNA病毒域，香港病毒界，有尾噬菌体门，有尾噬菌体目，肌尾噬菌体科，是一株未被发现的噬菌体。用OrthoANI算法对噬菌体PC79-13进行分析，热图(图8)显示其与大肠杆菌SUSP2有最高同一性95.28。
图7基于噬菌体PC79-13的全基因组构建进化树
图8噬菌体PC79-13的ANI分析
2.4.2噬菌体PC79-13的基因组功能注释
噬菌体PC79-13基因组共预测了59个编码区(CDS)，在这之中有23个CDS编码功能蛋白，包括1个参与表达噬菌体裂解酶的CDS，4个参与编码噬菌体结构、组装的CDS，16个参与编码噬菌体基因组复制、转录、蛋白质代谢的CDS，2个编码其他功能蛋白的CDS。此外，基因组中还含有20个编码tRNA的CDS(图9)。
图9噬菌体PC79-13的基因组圈图
2.5 FITC标记噬菌体
2.5.1 FITC标记噬菌体用于暗场检测沙门菌
FITC标记的噬菌体PC79-13(经宿主菌C79-13双层板滴度测定，FITC标记噬菌体滴度为9.2×109 PFU/mL，约损失8%滴度)与培养至对数生长期的鸡白痢沙门菌C79-13(菌浓度1.0×106 CFU/mL)混合于LB液体培养基中，孵育不同时间(10 min、15 min、20 min、25 min)后，用荧光显微镜观察。由于在荧光显微镜镜检前已将未与宿主菌结合的噬菌体经离心去除，因此荧光显微镜下观察空白对照样本与阴性对照中非宿主菌混合孵育的样本应不显示任何短杆状荧光。结果显示:孵育15 min的阳性样本，荧光显微镜下可见大量长度为2~5μm的短杆状荧光(图10A)，与明场下细菌分布一致(图10B)。而空白对照(只含有FITC标记的噬菌体PC79-13)与阴性对照(含有FITC标记的噬菌体PC79-13与非宿主细菌大肠杆菌CVCC1553孵育15 min)皆未观察到棒状荧光结构(图10C、D)，而将FITC标记的噬菌体侵染其余宿主菌，孵育15 min后制片置于荧光显微镜下观察，均可见清晰明亮的棒状结构，故表明FITC标记的噬菌体PC79-13可用于定向检测作为其宿主的一系列鸡白痢沙门菌。分析荧光显微镜下荧光棒状结构的多少及清晰度结果表明:同样条件下，孵育15 min，有最多、最完整清晰的荧光图像。孵育10 min，视野下荧光棒状结构较少;孵育20 min及25 min，有大量不完整的荧光碎片状结构。因此，最佳反应时间为15 min。
图10荧光标记噬菌体侵染宿主菌和非宿主菌显微(荧光和明场)观察(1 000×)
A、B:FITC-噬菌体侵染宿主菌荧光显微观察与明场观察C、D:FITC-噬菌体侵染非宿主菌荧光显微观察与明场观察
此外，我们也探索了FITC标记噬菌体的活性保存时间。在4个不同保存时间点(1周、2周、1个月、2个月)，取4℃避光保存的FITC标记噬菌体，利用宿主菌双层板测滴度。噬菌斑计数结果表明:保存1个月，噬菌体的滴度仅有约5%下降。但2个月却出现40%下降。2个月滴度下降明显的原因，可能是实验室洁净度不够，在操作中混入了其他细菌，导致噬菌体溶液的物质内容发生了变化，使近半数FITC标记的噬菌体失活。后续我们还要进行更为严谨的保存条件优化实验，以确定FITC标记噬菌体活性保持的最佳条件。
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