铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa，P.a)属于非发酵型革兰氏阴性杆菌，是医院内获得性感染中最常见的一种条件致病菌，可引起肺炎、尿路感染以及菌血症。当人体免疫功能低下时，例如在严重烧伤患者、癌症病人、术后患者以及免疫缺陷病毒感染的患者中可引起严重感染。2021年CHINET中国细菌耐药性监测数据显示，从301917份临床分离的标本中检出革兰氏阴性菌占71.4％，其中铜绿假单胞菌以7.96％排名第四位。在西班牙的一项研究中，从357名急性白血病合并血流感染的患者体内共分离出110种多重耐药菌，其中以铜绿假单胞菌为主，整体死亡率达14.8％。在美国，10％～30％的铜绿假单胞菌分离株对碳青霉烯类抗生素耐药，同时也是引起呼吸机相关性肺炎的主要病原体。抗生素的广泛使用、过度使用和滥用与抗微生物药物耐药性的爆炸性增长有关，铜绿假单胞菌也因多重耐药和泛耐药被世界卫生组织(World health organization,WHO)于2017年列入对人类健康构成最大威胁的全球优先病原体名单。因此，解决铜绿假单胞菌多重耐药问题已成为当务之急。
因此，研究和开发新型抗菌药物以解决日益严重的铜绿假单胞菌耐药问题已迫在眉睫，而抗菌肽是一个选择。
抗菌肽(Antimicrobial peptide，AMP)是生物体内一些具有抗菌活性的小分子多肽，在机体受感染或免疫刺激的诱导下产生，具有独特的抗菌机制及抑菌活性，对细菌、真菌、病毒、原虫以及肿瘤细胞等都具有一定的杀灭活性，部分具有免疫调节功能的抗菌肽甚至能够促进伤口愈合。有研究表明，昆虫抗菌多肽在抗药性发展方面优于单个肽和小分子抗生素，其独特的抗菌机制可减少细菌耐药性的产生。随着抗生素的滥用和超级耐药细菌的产生，昆虫抗菌肽已成为设计和开发新型抗菌药物的重要资源。
家蝇可作为抗菌肽研发的重要资源。已报道的与家蝇有关的抗菌肽包括攻击素(attacin)、天蚕素(cecropin)、防御素(defensin)、溶菌酶(lysozyme)、双翅肽(diptericin)等。目前，国内外对于家蝇抗菌肽的研究主要集中在分离、纯化和抗菌功能方面，对于抗菌机制的研究主要是针对金黄色葡萄球菌、大肠杆菌、鲍曼不动杆菌、沙门菌和真菌，而关于家蝇抗菌肽对于铜绿假单胞菌的抗菌活性和作用机制尚未有报道。
在前期研究中，课题组对家蝇3龄幼虫的全虫转录组进行测序，在转录组测序数据库中筛选出一条对家蝇免疫防御发挥积极作用且特异性高表达的基因，利用基因工程的方法成功合成出重组蛋白并命名为家蝇抗菌肽AMP-17(Musca domestica antimicrobialpepitides-17，AMP-17)，且对AMP-17基因进行了克隆表达、抗菌活性及时空表达模式的研究。有研究发现抗菌肽可以与菌体细胞外膜、细胞内膜相互作用，从而破坏膜结构引起细菌死亡，那抗菌肽AMP-17是否也可通过类似机制发挥抗细菌活性？因此，将抗菌肽AMP-17作用于金黄色葡萄球菌、大肠埃希菌、肺炎克雷伯菌及铜绿假单胞菌，结果显示均有抑制作用，其中对铜绿假单胞菌抑制作用较为明显，且对临床分离的耐药铜绿假单胞菌仍有较好的抗菌活性。
但现有技术中，抗菌肽AMP-17通过哪些途径发挥抗菌作用、是否破坏细菌细胞膜结构，其抗菌作用机制尚未可知，因此需要对以上问题提出一种新的解决方案。
家蝇抗菌肽AMP-17抑制铜绿假单胞菌的研究方法，至少包括以下步骤：
S1：进行抗菌活性的检测，抗菌活性的检测至少包括抗菌肽AMP-17对铜绿假单胞菌的最小抑菌浓度和最小杀菌浓度测试、生长曲线的检测、单位时间下杀菌曲线记录、抑制生物被膜形成实验、清除成熟生物被膜实验和绿脓菌素的测定；
S2：进行AMP-17抗菌机制研究，AMP-17抗菌机制研究至少包括扫描电子显微镜、透射电子显微镜、活死菌比例、外膜通透性、内膜通透性、活性氧水平检测；
S3：实验每组3个平行重复，所有数据经Graph Pad Prism 8.0.1处理后用平均值±标准差表示，T检验分析两组间差异，定义P＜0.05为差异具有显著性。
抗菌肽AMP-17对铜绿假单胞菌的最小抑菌浓度和最小杀菌浓度测试至少包括如下步骤：
将菌液在MHB肉汤培养基上转种2次，确保细菌的纯度及活力；
取1个单克隆菌落接种于LB液体培养基中培养至对数生长期，使用细菌比浊仪将菌悬液调至1×106CFU/mL备用；
将不同浓度的AMP-17与1.0×106CFU/mL菌悬液在96孔板中于37℃共同培养16～18小时；
从判定为MIC的孔及高于该孔药物浓度的孔中取100μL菌液稀释到合适浓度后在LB固体培养基上均匀涂布，37℃培养24小时，以LB固体平板上无细菌生长所对应的抗菌肽浓度为MBC。
生长曲线的检测至少包括以下步骤：制备1.0×106CFU/mL菌悬液，将菌悬液加入96孔板中；
与不同浓度的AMP-17共同置于37℃孵育24小时，每小时测定一次630nm处的吸光度值，记录结果并绘制生长曲线；
以4μg/mL多粘菌素B作为阳性对照，无菌MHB作为空白对照，添加菌悬液的MHB培养基为阴性对照；
单位时间下杀菌曲线记录至少包括以下步骤：以P.a CMCC 10104作为模型菌株，研究AMP-17随时间变化对该菌作用的影响，将25μg/mL的AMP-17和50μg/mL的AMP-17与1×106CFU/mL的菌悬液在37℃下孵育24h；
当孵育0、1、2、4、6、8、10、12、24h时，从中取10μL经AMP-17作用的菌悬液以十倍稀释度在MHB培养基中连续稀释至适当浓度；
吸取5μL稀释液在LB固体平板上点样，待菌落长出后计数菌落数并绘制单位时间下杀菌曲线。
表1多种抗菌药物对铜绿假单胞菌的MIC值生长曲线的检测：
参阅图1，未经AMP-17处理的对照组中P.a CMCC 10104生长曲线呈“S”型,在16小时后细菌生长到达静止期。经25μg/mL(1×MIC)的AMP-17作用后，P.a CMCC 10104生长在10h内受到抑制，当使用50μg/mL(2×MIC)的AMP-17处理后，培养至24h P.a CMCC 10104没有增长。
小结
通过观察经药物作用后细菌胞外形态、胞内结构、活死菌比例、外膜渗透性、内膜通透性等改变，从形态结构和分子水平方向对抗菌肽AMP-17对铜绿假单胞菌抗菌机制进行更便捷的研究，为设计具有良好抗菌活性的肽类抗生素提供新思路，为新型抗菌药物的开发奠定基础，为临床治疗提供新方向。
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