1.2实验方法
1.2.1甜樱桃流胶病原菌的鉴定用无菌解剖刀刮取0.1～0.2 g已在PDA培养基28℃暗培养活化的病原真菌SXYTLJ01的菌丝于1.5 mL离心管中,按SK8259(真菌)试剂盒操作提取基因组DNA,置于-20℃冰箱保存备用。应用真菌核糖体基因转录间隔区通用引物ITS1(5′-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3′)、ITS4(5′-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3′)和EF-1α-NS1(5′-GTAGTCATATGCTTGTCTC-3′)、EF-1α-NS6(5′-GCATCACAGACCTGTTATTGCCTC-3′),以分离得到的病原菌基因组DNA为模板进行PCR扩增;引物均由生工生物工程(上海)有限公司合成。25μL PCR反应体系:94℃预变性4 min,94℃45 s,55℃45 s,72℃1 min,共30个循环,72℃延伸10 min。扩增产物经1%琼脂糖凝胶电泳,在全能成像系统上观察并记录结果。PCR产物送往生工生物工程(上海)有限公司测序。靶基因序列进行BLAST比对,MEGA6.0程序处理,NJ邻接法构建系统进化树,分析病原菌的亲缘关系,以确定其分类学地位。
1.2.2菌丝结构的观察
利用光学显微镜进行菌丝结构观察:在回接有病原真菌SXYTLJ01的PDA上进行45°插片、28℃暗培养,培养3～7 d后用乳酸石炭酚棉蓝进行染色,镜检,观察该菌的菌丝形态结构。
1.2.3诱导产孢及孢子形态的观察
采用碳氮源缺乏、菌落划伤、近紫外线照射的方式诱导产孢。每组处理至少重复3次。
碳氮源缺乏:将活化后长势良好的菌株分别接种于不加碳源(葡萄糖)的马铃薯琼脂培养基和不加氮源(蛋白胨)的马铃薯葡萄糖琼脂培养基,28℃暗培养3～7 d,用乳酸石炭酚棉兰染色,镜检,观察产孢情况。
菌落划伤:将活化后长势良好的菌株接种于PDA培养基,28℃暗培养2～3 d,用无菌刀片沿培养基中部将菌落划至见皿底,再培养1～3 d,在伤口边缘取样,染色液染色,镜检,观察产孢情况。
近紫外线照射:将活化后长势良好的菌株接种于PDA培养基,12 h近紫外线(18 W,直径19 mm波长253.7 nm,距离培养基50 cm)照射后28℃暗培养2～3 d,镜检,观察产孢情况。
1.2.4最适生长条件利用平板测定法
研究葡萄座腔菌的最适生长条件:将活化后长势良好的菌株接种于PDA培养基中央,采用十字交叉法每天定时测定菌落直径。分别将温度、光照、pH、碳源、氮源这些因素作为单因素试验条件,探究不同条件下菌株的生长状况。每个处理至少重复3次,取其平均值。
温度的影响:将菌株接种于PDA培养基中央,以15、20、25、28、30、35、40℃七个温度作为试验温度梯度,暗培养,每24 h测量一次菌落直径。
光照的影响:将菌株接种于PDA培养基中央,分别进行全光照、全黑暗、12 h光照/12 h黑暗交替三种培养处理,28℃培养,每24 h测量一次菌落直径。
pH的影响:将菌株分别接种于pH为5.0、6.0、7.0、8.0、9.0、10.0的PDA培养基中央,28℃暗培养,每24 h测量一次菌落直径。
碳源的影响:将菌株接种于不含碳源和碳源分别为蔗糖、麦芽糖、淀粉、乳糖、葡萄糖的PDA培养基中央,28℃暗培养,每24 h测量一次菌落直径。
氮源的影响:将菌株接种于不含氮源和氮源分别为牛肉膏、蛋白胨、硫酸铵、硝酸钾、硝酸钠的PDA培养基中央,28℃暗培养,每24 h测量一次菌落直径。
1.2.5致病菌致死温度区间的确定
将活化后长满平板的菌落通过牛津杯取成直径约0.8 cm的菌饼,接取菌饼于5 mL PDB(马铃薯-葡萄糖肉汤培养基)培养基中,分别将试管放在35、40、45、50、55、60℃的恒温水浴锅中水浴20 min,对照组不水浴。水浴完成后将上述试管置于28℃摇速为180 r/min振荡箱中暗培养72 h,观察菌丝生长情况。
将上述震荡培养的菌液进行平板回接验证。具体步骤:长出菌丝球的,分别用镊子钳取大小相同的菌丝块于PDA培养基;菌饼未生长的,分别用镊子从菌饼上钳取同等大小的菌块于PDA培养基。28℃暗培养,连续观察3～7 d,看是否生长。如果菌株在PDB培养液中经某一温度区间水浴后振荡培养不生长,且回接PDA培养基也不生长,则将此温度区间确定为菌株SXYTLJ01的致死温度区间。
1.3数据处理
每组处理重复三次,取平均值;用Origin 8.0制图;用SPSS 22.0统计软件对差异显著性进行分析,P<0.05为显著水平,P<0.01为极显著水平;用MEGA6.0软件以NJ邻接法构建系统发育树。