2结果与分析
2.1噬菌体形态观察
以耐多药奇异变形杆菌为宿主菌，从污水中分离出一株新裂解性噬菌体，命名为vB_PMC-PL1（以下简称PL1）。噬菌体PL1在双层平板上形成了规则、均匀且透亮的噬菌斑，大小为1 mm（图1A）。通过透射电镜观察，噬菌体PL1头部直径为（91.43±2）nm，尾长（133.20±2）nm，为长尾噬菌体（图1B）。
图1噬菌斑形态（A）和噬菌体形态（B）
2.2噬菌体最佳MOI和一步生长曲线
MOI和一步生长曲线是评价噬菌体裂解活性的重要指标，对指导噬菌体治疗使用剂量或食品安全应用具有重要意义。如图2A所示，噬菌体PL1 MOI为0.1时，噬菌体效价最高，为10.34（lg（PFU/mL）），因此噬菌体PL1最佳MOI为0.1。按照最佳MOI绘制一步生长曲线（图2B），由结果可知噬菌体PL1的潜伏期为20 min，裂解量为106 PFU/cell。结果表明，噬菌体PL1对细菌有着良好的裂解能力。
图2最佳MOI（A）和一步生长曲线（B）
2.3噬菌体pH值稳定性和温度稳定性
优良的环境稳定性是噬菌体应用的前提。由图3A可知，噬菌体PL1在pH值范围为3～11时活性稳定，在pH值为2和12时噬菌体失活，结果表明噬菌体PL1具有较好的酸碱耐受性。由图3B可知，噬菌体PL1在4～50℃条件下活性稳定，当温度为60℃时，噬菌体完全失活，因此噬菌体PL1的最高耐受温度为50℃。结果表明噬菌体PL1具有较好的环境稳定性，可以应用于多种环境。
图3噬菌体PL1 pH值稳定性（A）和温度稳定性（B）
2.4不同MOI下噬菌体裂解效果
通过测定噬菌体PL1在不同MOI下的裂解活性来评价其抑菌能力。由图4可知，在12 h内各处理组OD600 nm值均有一定的增长，但均低于阳性对照，表明噬菌体PL1在低MOI下能抑制细菌的生长。
图4不同MOI值噬菌体PL1裂解曲线
2.5噬菌体宿主范围
由表1可知，噬菌体PL1能裂解奇异变形杆菌和普通变形杆菌，但对大肠杆菌、沙门氏菌、肺炎克雷伯菌和金黄色葡萄球菌没有裂解活性，表明噬菌体PL1对变形杆菌属显示出宿主特异性。
表1噬菌体PL1宿主范围
注：+.裂解，-.不裂解，PM.奇异变形杆菌，PV.普通变形杆菌。
2.6噬菌体全基因组分析
作为食品生物防治剂，噬菌体不能携带抗生素耐药基因、毒力基因等有害基因。为明确噬菌体PL1可否用于食品生物防治剂，对其全基因组分析，通过测序结果可知，噬菌体PL1的全基因组全长为103 381 bp，GC相对含量为38.89%。使用RAST注释软件共预测了158个开放阅读框（open reading frame，ORF），包括18个tRNA和140个其他类型的ORF，其中有63个ORF编码的功能蛋白已被注释。使用上述工具检测得出噬菌体PL1不携带抗生素抗性基因、毒力基因和整合酶相关基因（图5），具有良好的生物安全性。
图5噬菌体PL1基因圈图
2.7噬菌体进化树分析
使用NCBI比对噬菌体PL1末端酶大亚基的相关基因序列并进行系统发育树的构建。根据国际病毒分类委员会最新分类标准，表明噬菌体PL1是Demerecviridae家族Novosibvirus属的一个新成员（图6）。
图6基于噬菌体PL1末端酶大亚基基因的系统进化树分析
2.8噬菌体对生物被膜形成抑制能力测定结果
生物被膜是保护细菌免受外部环境影响的重要屏障，使细菌对抗菌剂、消毒剂等抗菌方式产生抗性。能否有效抑制或清除细菌生物被膜是检验噬菌体PL1应用指标之一。经过培养，测定PM B2在24、48 h和72 h时生物被膜OD595 nm值分别为0.97、1.20和0.79，PM B2生物被膜最佳形成时间为48 h。图7表明，按照不同MOI加入噬菌体PL1后，与对照组相比48 h内处理组均能显著地抑制细菌生物被膜的形成。
图7不同MOI下噬菌体PL1对生物被膜形成的影响
2.9噬菌体对生物被膜清除能力
如图8A可知，与对照组相比，噬菌体PL1可以显著降低细菌生物被膜含量，生物被膜清除率高达53.51%。经噬菌体PL1处理12 h后，生物被膜中的细菌浓度降低了1.44（lg（CFU/mL））；噬菌体PL1处理36 h，细菌浓度降低了1.00（lg（CFU/mL））（图8B）。结果表明，噬菌体PL1能有效清除奇异变形杆菌成熟生物被膜。
图8噬菌体PL1对细菌成熟生物被膜（A）和生物被膜内活菌（B）的清除能力
2.10噬菌体对不同材料上的细菌清除能力
在食品生产中，细菌易在不同材料上定殖形成生物被膜且不易被清除，导致食品受到细菌污染。结果显示，经噬菌体PL1处理12 h后，高密度聚乙烯上细菌含量由7.76（lg（CFU/cm2））下降到6.39（lg（CFU/cm2）），清除率为95.72%（图9A）；不锈钢材料上细菌数量下降了1.24（lg（CFU/cm2）），清除率达到94.33%（图9B）。处理36 h后，噬菌体对两种材料上细菌的清除率均高于90.00%，表明噬菌体PL1对不同材料上生物被膜有较强的清除作用。
图9噬菌体PL1对高密度聚乙烯（A）和不锈钢上（B）生物被膜清除作用
2.11噬菌体在鸡胸肉中的抑菌能力测定
在生鸡肉中奇异变性杆菌的检出率远高于其他肉类。因此，本研究选用鸡胸肉评价噬菌体PL1的抑菌作用。如图10A所示，与对照组相比，在4℃条件下，按MOI分别为1 000和10 000加入噬菌体PL1处理6 h后，鸡胸肉中细菌数量分别减少0.95（lg（CFU/g））和1.01（lg（CFU/g））。由图10B所示，与对照组相比，在25℃条件下，按MOI分别为1 000和10 000加入噬菌体处理9 h后细菌数量分别减少了1.50（lg（CFU/g））和1.67（lg（CFU/g））。在不同温度下，经噬菌体PL1处理12 h，与对照组相比均能显著减缓细菌的增长。结果表明，噬菌体PL1能有效抑制鸡胸肉中细菌的增长。
图10 4℃（A）和25℃（B）条件下不同MOI噬菌体PL1对鸡胸肉中细菌的抑制作用