研究简介：乳酸菌通常与发酵食品有关。由于它们“普遍被认为是安全的”称号以及对动物和人类健康肠道微生物群的贡献，这些细菌通常被用作益生菌。益生菌的许多健康益处已被报道，例如恢复肠道微生物群的平衡、支持免疫系统和改善一些心理健康状况。但许多研究人员认为，为了发挥其有益作用，益生菌需要在含有胆汁的肠道中存活。为了让益生菌在肠道中保持足够的数量，胆汁抵抗很重要，因为它决定了益生菌在胃肠道中的存活能力。因此胆汁酸耐受性是选择益生菌菌株的主要标准。然而，这个选择过程是劳动密集型和耗时的。
为了以合理和高通量的方式选择对胆汁具有高抗性的菌株，研究人员使用了Bioscreen c全自动生长曲线分析仪来筛选对胆汁有高抗性的菌株。BSH是一种重要的蛋白质，参与植物乳杆菌对胆汁酸的耐受性。有必要研究特定菌株的不同bsh基因在其抗不同胆汁酸毒性中的作用。植物乳杆菌是一种广泛研究和使用的益生菌，具有悠久的安全应用历史，植物乳杆菌携带四个bsh基因（bsh 1、bsh 2、bsh 3和bsh 4）。在这项研究中，植物乳杆菌的单、双和三bsh敲除突变体AR113是用CRISPR-Cas9基因编辑系统构建的，以评估单个bsh基因对不同胆汁酸加工的贡献，包括甘胆酸(GC)、甘鹅去氧胆酸(GCDC)、甘氨去氧胆酸(GDC)、牛磺胆酸盐(TC)、牛磺鹅去氧胆酸盐(TCDC)和牛磺脱氧胆酸盐(TDC)。该研究将提供证据，有助于合理高通量选择对胆汁酸具有高耐受性的菌株。
为了评估AR113和bsh敲除的植物乳杆菌菌株的生长，使用自动光密度监测系统Bioscreen C全自动生长曲线分析仪确定了MRS培养基中每个菌株的生长状态。将来自七种菌株的调整培养液的接种物（3%，v/v）接种到灭菌的MRS肉汤中。然后将各单独接种的菌液各200μL分别加入蜂窝板的单独孔中，将板置于Bioscreen C仪器中进行监测，温度为37℃。针对相应的未接种空白样品，每30分钟测量一次600 nm处的吸光度。对每个样品进行三个生物学重复。
实验结果：研究发现菌株的胆汁盐耐受性受到bsh 1和bsh 3的影响，这可以通过bsh 1或bsh 3缺失突变体相对于AR113暴露于胆汁盐时的细胞活力降低来证明。迄今为止许多研究都集中在建立BSH活性和胆汁盐抗性之间的关系上。然而，尚未获得一致的结果。该研究不仅建立了个体bsh基因与BSH活性之间的关系，而且揭示了bsh 1和bsh 3与甘氨酸结合胆汁盐抗性的关系。研究表明CRISPR-Cas9系统是构建bsh突变体的有效方法。BSH对甘氨酸结合胆汁盐具有底物偏好。此外研究结果证实了bsh 1和bsh 3是植物乳杆菌AR113中大部分BSH活性和胆汁盐抗性的原因。对BSH蛋白的进一步研究是必要的，这将有助于了解BSH在胆汁盐抗性中的机制，从而改善人类健康和疾病。
图1、质粒和bsh敲除菌株的构建。(A)敲除质粒的构建过程。(B)敲除质粒pLdbsh 1、2、3、4的构建。泳道：M，DNA标记；1、pHSP01；2-5，pLdbsh 1-4。(C)bsh单敲除菌株Δbsh 1、2、3、4的构建。bsh 1：泳道：M，DNA标记；1-15,Δbsh 1;16，AR113。bsh 2：泳道：M，DNA标记；1、AR113；2-12，Δbsh 2。bsh 3：泳道：M，DNA标记；1-12,Δbsh 3;13，AR113。bsh 4：泳道：M，DNA标记；1-15,Δbsh 4;16，AR113。
图2、本研究中使用的细菌菌株和质粒。
图3、敲除菌株的生长和BSH活性。(A)Bsh敲除菌株在MRS中的生长曲线(B)用5 mM牛磺酸结合胆汁盐定性检测MRS中BSH活性(C)用5 mM甘氨酸结合胆汁盐定性检测MRS中BSH活性。从图A中科院看出MRS肉汤中敲除菌株和AR113的生长期和最大生物量没有显着差异。这些结果表明植物乳杆菌AR113的生长在正常生长条件下不受bsh基因敲除的影响。图B中可以看出在含有5%TAC、TDC和TCDC的MRS板上未观察到沉淀环，这表明这三种胆汁盐没有被任何研究菌株水解。图C显示了与牛磺酸结合的胆汁盐相比，甘氨酸结合的胆汁盐在MRS板上产生清晰的沉淀圈。
图4、BSH对不同胆汁盐的影响。(A)bsh敲除牛磺酸结合胆汁盐的生长曲线。(B)bsh敲除甘氨酸结合胆汁盐的生长曲线。图A表示AR113的生长不受TAC、TDC和TCDC浓度的影响，可能是因为BSH对牛磺酸结合胆汁盐的水解作用极其有限。AR113对GC、GDC和GCDC表现出不同水平的抗性，但在测试浓度下对任何甘氨酸结合胆汁盐的耐受性没有不同水平（图B所示）。
图5、BSH对甘氨酸结合胆汁盐耐受性的影响。bsh敲除在MRS中的生长曲线，(A)0.3 g/L GC(B)3.0 g/L GC(C)5.0 g/L GC(D)0.3 g/L GDC(E)3.0 g/L GDC(F)5.0 g/L GDC(G)0.3 g/L GCDC(H)3.0 g/L GCDC(I)5.0 g/L GCDC。与AR113相比，0.3 g/L GC胆汁盐处理后bsh敲除菌株的生长没有明显变化。当GC浓度增加到3.0 g/L时，AR113的生长状态不受影响，AR113的最大比生长速率为0.52 OD600/h。Δbsh 2、Δbsh 3和Δbsh 4的生长与AR113的生长没有显著差异。然而，bsh 1缺失菌株（Δbsh 1、Δbsh 13、Δbsh 132和Δbsh134)受到显着抑制，这些菌株的最大比生长速率分别降低至0.25、0.20、0.21和0.22 OD600/h。这研究结果表明，bsh 1和bsh 3与胆汁盐耐受性密切相关，菌株、胆汁类型和胆汁浓度对胆汁盐耐受性有显著影响。
总结：益生菌对胆汁盐的抗性对其在肠道中的存活至关重要。胆汁盐水解酶(BSH)催化结合胆汁盐的去结合，并被认为与胆汁盐抗性有关。本研究旨在探讨不同bsh基因在植物乳杆菌AR113胆汁盐抗性中的作用。CRISPR-Cas9基因编辑用于构建单、双和三bsh敲除菌株。发现bsh 1和bsh 3基因的功能对植物乳杆菌中的BSH活性至关重要AR113。对六种胆汁盐的检查表明，甘氨酸结合的胆汁盐是BSH的首选底物。当用甘氨酸结合胆汁盐处理时，bsh1或bsh3敲除菌株的生长受到显着抑制。然而具有bsh2或bsh4敲除的菌株不受影响。这些结果表明bsh 1和bsh 3与胆盐抗性密切相关。该结果将有助于合理、高通量地选择对胆汁盐具有高耐受性的菌株。研究人员研究敲除基因的植物乳杆菌的生物活性使用了高通量的全自动生长曲线分析仪(Bioscreen C)筛选了对胆汁有高抗性的植物乳杆菌菌株，这些研究数据将提供证据，有助于合理高通量选择对胆汁酸具有高耐受性的菌株。