伤寒沙门菌是沙门菌属中经消化道感染人类的致病菌之一，可导致感染患者发生全身系统性感染，并能引发肠穿孔等严重的并发症，进而危及感染患者的生命。伤寒沙门菌作为食源性致病菌，必须克服人体肠道内的高渗应激环境才能最终致病。笔者在前期的研究工作中发现，在高渗应激环境下，伤寒沙门菌t4606基因的表达受到两个重要的sigma因子，即RpoE和RpoS的双重调控，提示t4606基因对伤寒沙门菌克服高渗应激环境极为重要。本研究利用原核生物基因敲除技术制备了伤寒沙门菌t4606基因缺陷株，并分析了其在高渗应激环境下的生物学特性，旨在通过分析t4606基因的功能，及其在沙门菌致病机制中的作用，为临床治疗和预防伤寒沙门菌感染提供可能的靶向基因。
1材料与方法
1.1菌株和质粒本试验所采用的伤寒沙门菌、自杀质粒及大肠埃希菌（E.coli）DH5α菌株由本实验室保存。
1.2试剂核酸限制性内切酶BglⅡ、BamHⅠ及用于聚合酶链反应（PCR）的EXTaq酶购自宝生物工程（大连）有限公司；质粒提取试剂、胶回收试剂及T4DNA连接酶购自美国Promega公司。
1.3方法
1.3.1 t4606基因缺陷株的制备利用原核生物基因同源重组技术制备t4606缺陷变异株，筛选连续3次传代均获得稳定重组的菌株作为t4606基因缺陷变异株，并采用序列分析进行验证。相关引物见表1。
1.3.2 t4606基因缺陷株回补株的制备设计特异性引物扩增t4606基因全长，上、下游引物的5′端分别加入NcoⅠ、SalⅠ酶切位点（见表1），扩增获得的全长片段经酶切后与表达载体pBAD／gⅢ（阿拉伯糖操纵元）连接，克隆至E.coli DH5α感受态细胞，利用质粒的氨苄西林抗性初步筛选阳性重组质粒，筛选获得的阳性重组质粒采用PCR及序列分析进行验证（由上海生工生物技术公司完成）。培养经验证确定的阳性重组菌株，提取重组质粒pBADt4606，电击导入t4606变异株，经酶切及PCR验证后命名为回补菌Δt4606（pBADt4606）。采用质量体积比（W／V）为0.2%的阿拉伯糖诱导质粒表达。
表1 PCR引物及序列
1.3.3生长曲线分析
基因缺陷株、缺陷回补株和野生株分别在37℃条件下，于LB培养液中振摇培养过夜；过夜培养后以1∶100的比例转入新鲜、预热的LB培养液，每隔1h检测培养液在600nm处的吸光度值（A600值），以A600值为纵坐标，培养时间为横坐标绘制生长曲线。用相同方法比较t4606缺陷株和野生株在高渗应激（300mmol／L NaCl）环境下的生存能力。每组实验重复3次。于对数生长早期（培养4h）和对数生长晚期（12h）比较不同菌株培养液的A600值。
1.4统计学处理
采用SPSS13.0软件进行数据处理和统计学分析。计量资料组间比较采用t检验；P＜0.05为比较差异有统计学意义。
2结果
2.1成功制备t4606基因缺陷株首先利用自杀质粒所具有的氨苄西林抗性，在含有氨苄西林的LB平板上筛选具有抗性的菌落，再进一步筛选耐蔗糖的菌落。以筛选获得的阳性菌落DNA为模板，用t4606基因上、下游引物P1A和P2B进行PCR扩增，分析伤寒沙门菌t4606基因的重组变异情况。PCR扩增检测相应菌落，直至筛选获得连续传代超过3次均仅有缺损片段的菌株。所获得的菌株即为稳定的t4606基因缺陷株。缺陷株及野生株PCR产物电泳结果见图1。经DNA序列分析，进一步证实702bp处被BglⅡ核酸限制性内切酶的6个碱基酶切位点所替代。
图1 t4606缺陷株及野生株PCR产物电泳图
2.2成功构建
回补菌株Δt4606（pBADt4606）为进一步证实t4606基因的功能，利用表达载体pBAD／gⅢ将t4606基因回补引入t4606基因缺陷株，构建回补菌株Δt4606（pBADt4606）。利用质粒的氨苄西林抗性，初步筛选携带回补t4606基因质粒的细菌后，提取质粒，进行酶切及PCR验证，酶切产物电泳结果见图2。DNA序列分析证实碱基序列与实验设计一致。
图2回补t4606基因的鉴定
相关新闻推荐
2、不同pH、Na2CO3、NaCl浓度对耐盐碱菌株NM-1生长曲线的影响——实验结果与讨论