鱼类是一种营养丰富的食物来源，因其多种营养价值而被推荐使用。它的饱和脂肪含量低，富含多不饱和脂肪酸(PUFA)和蛋白质。然而，鲜鱼在被屠宰后质量很容易变差。大多数鱼类被消化酶和脂肪酶、微生物腐败和表面细菌氧化降解。荧光假单胞菌和腐败希瓦氏菌是革兰氏阴性细菌，被认为是鱼和鱼产品冷藏过程中常见的特定腐败生物。近年来，研究人员付出了相当大的努力来寻找天然防腐剂，以减缓或抑制鱼类中细菌和真菌的生长。同时，越来越多的消费者意识到合成防腐剂对健康的潜在负面影响和天然添加剂的好处，这促使食品行业寻求天然产品作为替代品。许多来自植物的防腐剂已被证明具有抗氧化或抗菌特性。瑞香素（7,8-二羟基香豆素）是来源于植物的香豆素的二羟基衍生物。它是从韩国达芙妮中提取的植物活性元素，已报道具有抗微生物，抗氧化，抗疟药，抗凝，和免疫调节活性。然而，瑞香素对食源性腐败菌的潜在影响鲜有报道。因此，荧光假单胞菌和腐败希瓦氏菌，作为鱼和鱼制品中的特定腐败菌（SSOs），被选作目标的细菌，以评估对营养细胞瑞香素的抗菌活性和作用机制，以提供一个基础，瑞香素在食品替代化学防腐剂行业。
应用Bioscreen全自动生长曲线分析仪在30°C培养基中测试细菌的生长曲线。细菌在培养基中生长至OD值为0.1，然后将150uL培养物转移到100孔微量滴定板（Bioscreen，芬兰）的每个孔中。细菌悬液分别与1×、2×和4×MIC瑞香素混合。0×MIC用作对照。细菌在30°C下进一步培养，并使用自动微生物生长曲线分析仪在600 nm处监测细胞生长。以时间为横坐标，OD 600为纵坐标绘制生长曲线。
实验结果：本研究报道了瑞香素对荧光假单胞菌和腐败链球菌的抗菌活性及其作用机制。瑞香素对荧光假单胞菌的MIC为0.16 mg·mL-1，对腐败希瓦氏菌的MIC为0.08 mg·mL-1。瑞香素可以破坏荧光假单胞菌和腐败链球菌的细胞壁和膜完整性，导致核酸和蛋白质泄漏，影响细胞内的AKP和ATPase活性。SEM和TEM结果表明，瑞香素诱导形态学改变并导致细菌细胞中细胞内内容物的渗漏。荧光假单胞菌的FTIR光谱和S.putrefaciens起诉瑞香素破坏在膜和导致的生长抑制的核酸和蛋白质泄漏磷脂结构荧光假单胞菌和S.putrefaciens。总体而言，研究结果表明，瑞香素是一种很有前途的天然防腐剂，可用作食品工业中合成防腐剂的潜在替代品，为增强微生物灭活提供了可行的策略。
图1、瑞香素对荧光假单胞菌(a)和腐败假单胞菌(b)的生长曲线。绘制了两种试验细菌在不同浓度瑞香素存在下的生长情况，以进一步分析瑞香素的抗菌活性。如图(a)所示，对照组细菌的生长与S形生长曲线一致。荧光假单胞菌在没有瑞香素的情况下快速生长，6小时后开始进入指数噬菌体，26小时后进入稳定期。然而，用1×、2×和4×MIC浓度的瑞香素处理的组完全抑制了细菌的生长。腐败假单胞菌（图(b))不添加瑞香素的情况下，14小时后开始呈指数期，28小时后进入稳定期。加入1×MIC瑞香素后，腐败假单胞菌的生长速度比对照慢。30 h后抑制作用逐渐减弱，细菌生长开始进入对数期。然而，当添加2×MIC和4×MIC浓度的瑞香素时，可以完全抑制细菌的生长。
图2、碱性磷酸酶(AKP)活性(a)、细胞内核酸(b)和细胞内蛋白质的渗漏(c)、蛋白质渗漏(d)以及瑞香素对荧光假单胞菌和腐败链球菌的ATPase活性(e)。
图3、用瑞香素处理的荧光假单胞菌(a)和腐败链球菌(b)的傅里叶变换红外(FTIR)光谱。
图4、荧光假单胞菌（a）和腐败希瓦氏菌(b)的扫描电子显微照片（A1–B1，对照；A2–B2，添加1×MIC瑞香素；A3–B3，添加2×MIC瑞香素；A4–B4，添加4×MIC瑞香素。
图5、荧光假单胞菌（a）和腐败希瓦氏菌(b)（A1-B1，对照；A2-B2，添加4×MIC瑞香素）的透射电子显微照片。
总结：本论文主要研究评估了瑞香素对荧光假单胞菌和腐败希瓦氏菌的抗菌活性和作用机制。瑞香素对荧光假单胞菌和腐败链球菌的最小抑菌浓度(MIC)分别为0.16和0.08 mg·mL-1。应用Bioscreen全自动生长曲线分析仪获得的生长曲线试验也表明瑞香素具有良好的抗菌作用。细胞内成分渗漏和细胞活力分析结果表明，瑞香素破坏了细胞膜的形态。根据扫描电镜和透射电镜观察，处理后的两株菌体细胞膜形态和超微结构发生明显变化，证实了瑞香素对细胞膜完整性的破坏。研究结果表明，瑞香素主要通过破坏细胞膜发挥抗菌作用，表明其具有作为天然食品防腐剂的良好潜力。