1材料与方法
1.1材料
1.1.1试验用菌株和噬菌体来源
本实验所涉及的12株沙门菌(包括4株肠炎沙门菌、4株鸡白痢沙门菌及4株鼠伤寒沙门菌)和52株大肠杆菌信息详见表1。分离噬菌体的污水样品采集于扬州市邗江区文昌中路附近的二道河水系。
表1宿主谱测定涉及细菌信息
菌株编号细菌16S鉴定细菌来源
C79-13鸡白痢沙门菌中国兽医药品监察所
CVCC535鸡白痢沙门菌中国农业科学院家禽科学研究所
CVCC540鸡白痢沙门菌中国兽医微生物菌种保藏中心
CVCC534鸡白痢沙门菌中国兽医微生物菌种保藏中心
CMCC50336肠炎沙门菌中国兽医药品监察所
C50041肠炎沙门菌中国兽医药品监察所
ATCC13076肠炎沙门菌中国农业科学院家禽科学研究所
CVCC3377肠炎沙门菌中国兽医微生物菌种保藏中心
CVCC542鼠伤寒沙门菌中国兽医微生物菌种保藏中心
W32鼠伤寒沙门菌中国兽医药品监察所
J002鼠伤寒沙门菌中国兽医药品监察所
S002鼠伤寒沙门菌中国兽医药品监察所
BL21(DE3)大肠杆菌赛默飞世尔公司
XL1-Blue大肠杆菌上海维地生物技术有限公司
CVCC1553大肠杆菌中国兽医微生物菌种保藏中心
S14大肠杆菌北京全式金有限公司
DH5α大肠杆菌赛默飞世尔公司
ER2738大肠杆菌北京天恩泽基因科技有限公司
T144大肠杆菌广州碧云天生物有限公司
TG1大肠杆菌广州碧云天生物有限公司
BLT 5403大肠杆菌北京天恩泽基因科技有限公司
ATCC25922大肠杆菌中国兽医微生物菌种保藏中心
AD5大肠杆菌实验室保藏
AE1大肠杆菌实验室保藏
AE4大肠杆菌实验室保藏
AG4大肠杆菌实验室保藏
Y AD2大肠杆菌实验室保藏
Y AE1大肠杆菌实验室保藏
Y AE2大肠杆菌实验室保藏
Y AE4大肠杆菌实验室保藏
Y AF4大肠杆菌实验室保藏
Y AG3大肠杆菌实验室保藏
X5大肠杆菌实验室保藏
YX1大肠杆菌实验室保藏
YX2大肠杆菌实验室保藏
YX5大肠杆菌实验室保藏
YX6大肠杆菌实验室保藏
W5大肠杆菌实验室保藏
W6大肠杆菌实验室保藏
YW1大肠杆菌实验室保藏
YW2大肠杆菌实验室保藏
YW4大肠杆菌实验室保藏
Y6大肠杆菌实验室保藏
AA2大肠杆菌实验室保藏
YY1大肠杆菌实验室保藏
YZ4大肠杆菌实验室保藏
YZ6大肠杆菌实验室保藏
YAA5大肠杆菌实验室保藏
YAA6大肠杆菌实验室保藏
V1大肠杆菌实验室保藏
W1大肠杆菌实验室保藏
M1大肠杆菌实验室保藏
M2大肠杆菌实验室保藏
YM4大肠杆菌实验室保藏
P2大肠杆菌实验室保藏
YL1大肠杆菌实验室保藏
YL3大肠杆菌实验室保藏
YO1大肠杆菌实验室保藏
YP3大肠杆菌实验室保藏
YS2大肠杆菌实验室保藏
1--1大肠杆菌实验室保藏
Y3-2大肠杆菌实验室保藏
Y108-1大肠杆菌实验室保藏
Y193-1大肠杆菌实验室保藏
1.1.2主要使用试剂及仪器
氯化钠、胰蛋白胨、酵母粉购自英国Oxoid公司，0.22μm滤器购自浙江塞恩斯科学仪器有限公司，FITC(异构体Ⅰ)购自上海阿拉丁生化科技股份有限公司，蛋白酶K、脱氧核糖核酸酶、核糖核酸酶购自翌圣生物科技上海有限公司。透射电镜(HT7800，日本日立高新技术公司)和正置荧光显微镜(BX53，日本奥林巴斯)皆属于扬州大学大型设备共享平台。
1.2噬菌体分离与纯化
1.2.1噬菌体初筛
将采集的污水样品经纱布过滤去大颗粒杂质后分装至50 mL离心管中，10 000×g离心10 min后弃去沉淀，取上清液过0.22μm滤器，此为噬菌体原液，分装于2 mL离心管内存于冰箱4℃备用。
1.2.2噬菌体富集
取20μL冻存于-80℃的鸡白痢沙门菌C79-13加入1 mL LB液体培养基中，在37℃摇床中200 r/min过夜培养作为种子液。按1%比例将种子液重新接种到1 mL LB液体培养基中，培养至至对数生长期(OD600=0.6)时，加入100μL噬菌体原液继续培养3 h后取出，10 000×g离心10 min后收集上清液，经0.22μm滤器过滤，滤液转入2 mL离心管中保存。
1.2.3噬菌体的分离与纯化
取100μL处于对数生长期的鸡白痢沙门菌C79-13与100μL少量富集得到的噬菌体液混合，用移液器吹打混匀后全部转移到5 mL LB半固体培养基中混匀，铺于双层琼脂平板的底层胶上，静置待上层琼脂液体凝固后，倒置于37℃恒温箱中培养6 h，直至双层琼脂平板上出现清晰、透亮、大小均一的噬菌斑。用移液器灭菌枪头挑取单个透亮的噬菌斑加入1 mL PBS缓冲液中，并用移液器灭菌枪头反复吹打使噬菌斑中噬菌体分散入溶液中，10 000×g离心10 min弃沉淀，取上清液过0.22μm滤器，取过滤液体与对数生长期宿主菌混合，用双层琼脂平板法重复纯化5~6次直至双层平板上出现的噬菌斑大小一致、透亮程度均一。
1.3噬菌体形态透射电镜观察
用CsCl密度梯度离心法，将浓缩后的噬菌体颗粒滴在铜片上，静置3 min，用滤纸吸去周围多余液体，滴加20μL 2%的磷钨酸(PTA，2%m/V)染色10 min，并在室温下静置干燥后，使用透射电镜观察噬菌体形态。
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