溶藻弧菌(Vibrioalginolyticus)属于弧菌科(Vibrionaceae)弧菌属(Vibrio)，为革兰氏阴性短杆菌，无荚膜和芽孢，是广泛存在于海水中的一种条件致病菌。它不仅对于鱼、虾、贝有致病性，同时对于人类也有一定的致病性，能够引起腹泻和食物中毒。而对于溶藻弧菌的防治，养殖户通常使用传统的抗生素或者消毒剂，但抗生素的滥用会导致养殖过程中溶藻弧菌产生耐药性，不仅影响用药效果，同时耐药菌还会随着食物链的传播感染人类，危害人类生命安全。另一方面，随着人们生活水平的不断提高，大众在食品的选择上对绿色理念越发的重视。因此，亟需寻找一种新的既环保、友好又能有效控制水产养殖动物溶藻弧菌病的方法。
噬菌体作为一种微生物病毒，能够侵染并裂解细菌、螺旋体、放线菌等。早在20世纪初期，噬菌体就被认为有替代抗生素的巨大潜力。相比于抗生素的高效，有关噬菌体疗法的研究始终落后于抗生素的研究。但随着近年来细菌耐药性问题趋向严峻，研究者重新将目光投向噬菌体，期望能够开发出高效的噬菌体制剂。2009年，Wright等首次在感染多重耐药铜绿假单胞菌的慢性耳炎患者身上使用噬菌体治疗方案，经过治疗后，患者的症状均得到改善，并且没有产生毒副作用。Cao等从临床患者体内分离得到一株多重耐药性肺炎克雷伯菌，并用其感染小鼠，随后使用噬菌体进行治疗，结果发现未使用噬菌体治疗的小鼠在24 h内全部死亡，而使用噬菌体治疗的小鼠存活率则高出许多。此外，噬菌体在弧菌病防治方面的研究也取得了一些成果。Stalin等研究发现，在斑节对虾幼体感染哈维氏弧菌后，使用噬菌体能够有效提高幼体的存活率。胡蝶等将副溶血弧菌制成噬菌体微胶囊，并拌于饲料中投喂方斑东风螺和南美白对虾，发现实验生物的肠道和水体中的宿主菌都有大幅度的减少。于鸽从自然水体中分离得到一株溶藻弧菌噬菌体，并将其用于南美白对虾的攻毒实验，结果表明108pfu/mL的噬菌体溶液的保护率达88.20%。Sasikala等分离得到的一株溶藻弧菌噬菌体能够有效抑制溶藻弧菌的生物膜形成，并且在数个小时后还对溶藻弧菌有杀灭作用。
本文以溶藻弧菌V039为宿主，分离得到一株新型溶藻弧菌噬菌体φV039C，并对其进行了电镜形态观察、最佳感染复数、一步生长曲线等生物学特性的研究，以及全基因测序、序列分析和功能预测，以期更好地了解其裂解机制，为溶藻弧菌的噬菌体治疗提供依据。
1、材料与方法
1.1材料
宿主菌：病原菌(溶藻弧菌V039)从福建漳浦的对虾养殖场中分离得到，并由本实验室保藏。
主要试剂和仪器：LB肉汤、营养琼脂(NA)、琼脂粉、SM病毒提取缓冲液均购自青岛海博生物技术有限公司；DL15000、DL2000、DNase I、RNase A和限制性内切酶(EcoR I、EcoR V、BamH I、HindⅢ)均为日本TaKaRa公司产品；TIANamp病毒基因组DNA/RNA提取试剂盒购自天根生化科技有限公司；透射电子显微镜(TEM)为美国FEI公司制造产品；离心机(Eppendorf 5427R)为德国艾本德公司产品。
1.2方法
1.2.1噬菌体的分离
将取自福建漳浦各对虾养殖场的水样混合于洁净的水桶中，再把培养至对数期的溶藻弧菌V039菌液倒入水样中，混匀后置于30℃恒温培养箱中24 h，以富集潜在噬菌体。之后，取5 mL富集液10 000 r/min离心3 min，上清液用0.22μm滤膜过滤备用。吸取100μL V039菌液均匀涂布在营养琼脂(添加体积分数为2%的NaCl)上，吸取10μL富集液分数滴点于平板上，晾干后置于30℃培养，24 h后观察点接处是否有空斑出现，如有空斑即作为溶藻弧菌V039的噬菌体进行挖斑纯化。
1.2.2噬菌体的纯化与效价测定
采用双层平板法进行纯化和效价测定。将噬菌体形成的空斑挖到SM缓冲液中，4℃过夜。用无菌生理盐水将浸提液稀释到合适梯度，吸取100μL稀释液和100μL宿主菌液至6 mL半固体(含质量分数为0.65%的琼脂)LB肉汤(提前置于50℃保温)中混合均匀，倾倒在营养琼脂(添加体积分数为2%的NaCl)上，凝固后30℃培养16 h。挑取单个噬菌斑至SM缓冲液中4℃过夜，重复上述操作对分离得到的噬菌体纯化3～5次。噬菌体效价(TT)指的是每毫升样品中含有的具有侵染性的噬菌体颗粒数，又称噬菌斑形成单位数(plaque-forming unit)。检测样品梯度稀释后做双层平板法培养，每个梯度设3个平行，取噬菌斑颗粒数在30～300 pfu之间为有效数据，以平均数计算噬菌体密度。
1.2.3噬菌体电镜观察
取噬菌体增殖液20μL(>1010pfu/mL)滴到铜网上吸附30 min，用2%(体积分数)磷钨酸(PTA)负染10 min，室温干燥后，用透射电子显微镜观察并拍摄噬菌体的形态，同时测量头部直径等数据。
1.2.4噬菌体基因组的提取和酶切分析
取噬菌体增殖液(≥1010pfu/mL)至无菌EP管中，分别加入DNase I与RNase A于37℃反应1 h，以去除噬菌体增殖液中游离的宿主菌DNA/RNA，80℃处理15 min使酶失活。之后，利用TIANamp病毒基因组DNA/RNA试剂盒提取噬菌体基因组。
酶切反应体系为10μL。分别取噬菌体基因组8μL于6个无菌PCR管中，再分别加入1μL的酶(DNase I、RNase A、EcoR I、EcoR V、BamH I、Hind III)以及1μL的10×Loading Buffer，于37℃反应1 h。将酶切产物置于1%(质量分数)琼脂糖凝胶中电泳(110 V)24 min，使用凝胶成像系统观察电泳结果。
1.2.5噬菌体最佳感染复数测定
感染复数(multiplicity of infection，MOI)，指的是噬菌体在感染开始时噬菌体与宿主菌的比值。测定方法：培养宿主菌液至生长对数期，按MOI值为1000、100、10、1、0.1、0.01、0.001、0.0001、0.000 01各吸取50μL的噬菌体液和宿主菌液到900μL无菌LB肉汤中，30℃、160 r/min培养8 h，10 000 r/min离心2 min，用0.22μm滤膜过滤，测定噬菌体效价。效价最高的感染复数即为最佳感染复数。
1.2.6噬菌体一步生长曲线测定
按照感染复数为0.1的比例，混合噬菌体液和宿主菌液，宿主菌液浓度为1×108cfu/mL，总体积为1 mL，30℃孵育10 min，让噬菌体充分吸附在宿主菌上，10 000 r/min离心2 min，弃上清液，用LB肉汤洗涤2次去除未吸附的噬菌体，加入1 mL LB肉汤重悬。置于30℃的恒温培养箱中振荡培养，并开始计时，分别在0、10、20、30、40、50、60 min时间点取样，测定噬菌体效价并绘制生长曲线。
1.2.7噬菌体的全基因组测序及生物信息学分析
噬菌体φV039C的基因组利用第三代单分子测序平台(PacBio SMRT)进行全基因组测序分析。利用GeneMarkS(http://topaz.gatech.edu/GeneMark/)网站进行基因预测。使用在线blastp工具(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST)进一步对预测的基因进行注释。使用软件DNA Plotter绘制全基因组圈图。用MEGA 7.0软件，选择N-乙酰壁氨酰-L-丙氨酸酰胺酶(ORF6)和大亚基终止酶(ORF19)两种蛋白进行系统进化树的构建。