生物膜是附着在表面并封闭在细胞外聚合物基质(EPS)中的结构化微生物联合体。与浮游状态下的细胞相比，生物膜的主要特性是对抗菌剂和其他类型压力的高抵抗力。这使得生物膜很难根除。生物膜存在于医学领域的许多类型的非生物表面上，由于它们可以储存和分散多种感染因子，因此会导致慢性感染等严重问题。假单胞菌在环境中无处不在，其中一些会导致动植物感染。在假单胞菌属物种中，铜绿假单胞菌是一种普遍存在的机会性人类病原体，可引起广泛的急性和慢性危及生命的感染，尤其是在免疫系统受到抑制的患者。肠球菌种类中，粪肠球菌是最普遍的医疗保健相关病原体，通常引起菌血症、尿路感染、脓肿感染、腹膜炎、心内膜炎以及褥疮和足部溃疡。80–90%的医疗保健相关肠球菌感染都涉及这种细菌。
生物膜结构细菌对抗生素和其他抗菌剂成分的耐药性主要由EPS基质支持，这限制了生物膜内杀菌剂的传输。因此，需要一种有效灭活细菌生物膜细胞的新方法来控制生物膜。研究人员研究了将EPS降解酶与抗菌剂结合使用的策略在生物膜处理中的潜在应用。
EPS降解酶与生物杀灭剂结合使用时，可以分散嵌入生物膜中的细菌，从而实现更有效的消毒。以基质为目标还可能扰乱粘弹性，从而进一步降低生物膜内聚力并改善抗菌剂的获取和效率。这种使用靶向基质蛋白的蛋白水解酶与抗菌剂结合使用的方法尚未得到充分研究，无法有效灭活生物膜中的铜绿假单胞菌和粪肠球菌细胞。在这项研究中，研究人员研究了两种能够靶向基质蛋白的蛋白水解酶胃蛋白酶和胰蛋白酶降解铜绿假单胞菌和粪肠球菌的潜力生物膜和与香芹酚结合时的协同效应，香芹酚是一种天然单萜酚，具有广泛的抗菌和抗生物膜活性。
Bioscreen全自动生长曲线分析仪的应用
肉汤微量稀释法用于确定香芹酚对两种细菌菌株的最小抑菌浓度(MIC)。使用无菌Müller–Hinton肉汤将细菌悬浮液调整至106 CFU mL-1。首先，将100µL MHB添加到微量滴定板的每个孔中。然后，在0.156至10 mg mL-1的微量滴定板中制备辅以DMSO的香芹酚溶液的两倍连续稀释液.最后，每孔加入100µL细菌悬浮液。阴性对照中不添加细菌，含有DMSO的阳性对照中不添加抗菌剂。将板在37°C下在Bioscreen C中培养，同时连续搅拌，并在24小时内每2小时读取一次OD600 nm。
实验结果
结果表明，铜绿假单胞菌和粪肠球菌胃蛋白酶或胰蛋白酶与香芹酚联合处理比单独使用香芹酚处理更能减少生物膜。与使用单一酶然后香芹酚处理相比，在顺序酶处理后香芹酚处理后，两种生物膜的减少明显更为重要。这种提高的效率在落射荧光显微镜分析中也很明显，该分析表明，单独或顺序使用酶，然后是香芹酚的联合处理，表现出酶的分散活性和香芹酚抗微生物活性的协同作用，因为生物膜在以下方面更加减少生物量和生存能力。蛋白质可以成为去除的良好目标，以允许香芹酚等消毒剂有效渗透，以灭活生物膜中的铜绿假单胞菌和粪肠球菌细胞。酶和香芹酚可以通过封装到非生物材料中来稳定。包封可以增强这些活性剂的抗生物膜活性并提高其稳定性。
图1、香芹酚对铜绿假单胞菌(a)(5 mg mL−1)和粪肠球菌(b)(0.625 mg mL−1)浮游细胞的最小抑制浓度(MIC)。在三个独立实验中，在24小时的孵育期内，使用分光光度计以2小时的间隔在OD600 nm下使用不同浓度的香芹酚测量细菌浊度。使用含有DMSO的对照。
图2、香芹酚对铜绿假单胞菌(a)(5 mg mL−1)和粪肠球菌(b)(0.625 mg mL−1)浮游细胞的最小抑制浓度(MIC)。在三个独立实验中，在24小时的孵育期内，使用分光光度计以2小时的间隔在OD600 nm下使用不同浓度的香芹酚测量细菌浊度。使用含有DMSO的对照。
图3、使用不同浓度(10−4–10 mg mL−1)和不同作用时间(30分钟)的胃蛋白酶和胰蛋白酶分散已建立的铜绿假单胞菌(a,b)和粪肠球菌(c,d)生物膜。在37°C下在96孔聚苯乙烯板中研究生物膜分散。在OD600下测量总生物膜形成。结果表示为三个独立实验的平均值(±SD)。*p<0.05表示与使用Tukey检验的对照相比存在显著差异。
图4、铜绿假单胞菌(a,b)和粪肠球菌(c,d)细胞在胃蛋白酶(a,d)和胰蛋白酶(b,d)存在下于37°C下培养24小时的生长情况颤抖。在三个独立的实验中，在24小时的孵育期内，使用分光光度计以2小时的间隔在OD600 nm处用不同浓度的酶测量细菌浊度。
图5、用胃蛋白酶、胰蛋白酶处理后铜绿假单胞菌生物膜的落射荧光显微图像，或以1 mg mL−1的浓度连续处理两者各1小时，或随后用½MIC的香芹酚处理（2.5 mg mL−1)持续1分钟。在用SYTO9（活细菌的绿色荧光）和碘化丙啶（死细菌的红色荧光）染色后观察细胞。对照代表用胰蛋白胨盐肉汤处理的生物膜。
总结
生物膜由封闭在自产细胞外基质中的微生物群落组成，该基质主要负责生物膜的毒力。以这种基质为目标可能是控制生物膜的有效策略。在这项工作中，研究人员检查了两种蛋白水解酶胃蛋白酶和胰蛋白酶降解铜绿假单胞菌和粪肠球菌的功效生物膜及其与香芹酚结合时的协同作用。酶的最小分散浓度(MDC)和接触时间，以及香芹酚的最小抑制浓度(MIC)和接触时间，是针对在聚苯乙烯表面上生长的生物膜确定的。对于在不锈钢表面上生长的生物膜，胃蛋白酶或胰蛋白酶与香芹酚的组合处理与单独的香芹酚处理相比，两种生物膜的减少更为显着。这种减少在连续处理两种酶后更为显著，其次是香芹酚，最大减少量铜绿假单胞菌为4.7 log CFU mL-1，对于粪肠球菌为3.3 log CFU mL-1。这种提高的效率在落射荧光显微镜分析中也很明显。这些发现表明，蛋白酶分散活性和香芹酚抗微生物活性的综合作用可能是控制铜绿假单胞菌和粪肠球菌生物膜的前瞻性方法。本研究工作表明，使用酶和精油的联合治疗可能是根除微生物生物膜感染的有前途的技术。这些天然试剂的使用将进一步减少化学试剂的使用、能源成本和生物膜控制所需的水消耗。