2结果与分析
2.1分离菌株的生长特性和形态学特征
从扎布耶盐碱湖水样中分离获得盐单胞菌10株(表2)，其菌落形态多呈圆形、淡黄色，部分菌株呈白色。参照文献[14]确定分离菌株均属于极端嗜碱盐菌(1.53 mol/L<盐度<5.53 mol/L，pH>10.0)。16S rRNA基因序列分析显示：盐单胞菌分属5个种，其中嗜碱盐单胞菌(H.alkaliphila)4株，占40%，樊氏盐单胞菌(H.venusta)3株，占30%，铬还原盐单胞菌(H.chromatireducens)1株，占10%，热液盐单胞菌(H.hydrothermalis)1株，占10%，坎帕尼亚盐单胞菌(H.campaniensis)1株，占10%。初步检测10株盐单胞菌的胞内ectoine，显示积聚量为0.00−303.62 mg/L。分离株嗜碱盐单胞菌H.alkaliphila ZB109的耐盐碱能力良好，生长盐度0.0−3.0 mol/L，pH 8.0−11.0，ectoine积聚量较高(303.62 mg/L)。菌株ZB109的菌落形态(图1A)呈圆形，淡黄色，不透明，中心隆起，边缘光滑；革兰氏染色阴性，显微形态呈长杆状，单个或成串排列(图1B)，扫描电子显微镜形态(图1C)呈长圆柱状，长度约10μm，菌体轮廓清晰圆润，部分发生粘连，表面绒毛感颗粒状聚合物，周身具有少量细短纤毛。
表2分离菌株耐盐耐碱范围和ectoine积聚量
图1菌株ZB109的菌落形态(A)、菌体形态(B)和细胞形态(C)
2.2菌株ZB109的生理生化鉴定结果及系统发育树
参照《常见细菌系统鉴定手册》[17]和《伯杰细菌鉴定手册》[18]进行菌株ZB109的碳氮源利用与生理生化鉴定。结果显示：该菌株能利用精氨酸、赖氨酸、(NH4)2SO4、NH4Cl、KNO3、葡萄糖、甘露醇、肌醇、山梨醇、鼠李糖、蔗糖、蜜二糖、苦杏仁甙、阿拉伯糖、柠檬酸、淀粉和麦芽糖作为唯一碳氮源生长，不能利用鸟氨酸和乳糖，β-半乳糖苷酶(ONPG)和脲酶试验为阳性，V-P试验、产H2S试验、吲哚试验和明胶液化试验均呈阴性，与盐单胞菌菌株H.ventosae QHL5[16]、Halomonas sp.QHL25[19]和Halomonas sp.A20[20]的相关结果一致。16S rRNA基因序列比对分析显示，菌株ZB109与H.alkaliphila(KR140235.1)的相似性最高(99.78%)。使用MEGA v.11.0软件构建系统发育树(图2)，初步确定菌株ZB109(OR651760.1)与盐单胞菌属菌株进化同源，分类隶属于变形菌门(Proteobacteria)γ-变形杆菌纲(Gammaproteobacteria)海洋螺菌目(Oceanospirillales)盐单胞菌科(Holomonadaceae)盐单胞菌属(Halomonas)嗜碱盐单胞菌(H.alkaliphila)。
图2菌株ZB109及其近源属种的系统发育分析
分支数字是自展值；距离标尺数字是相对进化长度；括号中数字是菌株的GenBank登录号
2.3菌株ZB109胞内ectoine积聚量的单因素试验
设置单因素浓度分组(NaCl、Mg2+、Ca2+、MSG、CaCO3及pH)，利用ectoine发酵培养基37℃、180 r/min培养48 h，检测菌株ZB109的生物量和胞内ectoine的积聚量(图3)。综合分析显示：菌株ZB109积聚ectoine的最适NaCl浓度是1.5 mol/L，积聚量为558 mg/L(图3A)；最适Mg2+浓度是0.1 mol/L，积聚量为570 mg/L(图3B)；最适Ca2+浓度是4.0µmol/L，积聚量为576 mg/L(图3C)；最适MSG浓度是0.08 mol/L，积聚量为529 mg/L(图3D)；最适CaCO3浓度是20 g/L，积聚量为551 mg/L(图3E)；最适pH值10.0，积聚量为236 mg/L(图3F)。甄选NaCl、Mg2+、Ca2+、MSG、CaCO3的最适浓度，进行Plackett-Burman关键单因素的变量试验。
图3不同单因素条件下菌株ZB109的生长量(OD600)和ectoine积聚量
A：NaCl浓度；B：Mg2+浓度；C：Ca2+浓度；D：MSG浓度；E：CaCO3浓度；F：pH
2.4 Ectoine发酵条件优化结果
基于Plackett-Burman试验筛选影响菌株ZB109胞内ectoine积聚量的显著因素(表3)。结果显示：模型方差F值为10.31，P<0.05，表明模型具有统计学意义。3个关键因子的变化显著影响菌株ZB109的胞内ectoine积聚量(P<0.05)，影响强度依次为NaCl(X1)>Mg2+(X2)>MSG浓度(X4)，而Ca2+(X3)与CaCO3浓度(X5)的变化无显著影响(P>0.05)。使用Design-Expert v.11.0软件拟合实验模型，建立线性回归方程：Y=232.10−143.31X1−71.08X2−0.619 4X3+66.59X4−34.09X5，式中Y为ectoine积聚量，因素X1−X5分别为NaCl、Mg2+、Ca2+、MSG和CaCO3浓度。回归决定系数R2=0.837 5，模型拟合程度较好；修正决定系数R(Adj)2=0.756 3，表明75.63%的响应值变化可以通过拟合模型进行解释。
表3 Plackett-Burman法方差分析结果
优选NaCl、Mg2+和MSG浓度进行Box-Behnken试验设计，使用软件Design-Expert v.11.0进行多元线性回归拟合分析(表4)。以ectoine积聚量(Y)为响应值，建立NaCl(A)、Mg2+(B)和MSG浓度(C)的响应面模型：Y=680.02−23.84A−17.25B−15.52C−1.91AB−19.13AC+4.16BC−40.88A2−32.34B2−69.38C2。方差分析显示(表5)：该模型显著(P<0.05)，失拟项不显著(P>0.05)，R2=0.974 5，F=29.77，模型拟合程度较好，修正决定系数R(Adj)2=0.941 8，表明94.18%的响应值变化可以通过拟合模型进行解释，并分析和预测ectoine的积聚量。由各因素P值可知，NaCl浓度(A)、Mg2+浓度(B)和MSG浓度(C)为显著影响因素，其中NaCl浓度影响程度最大，其次是Mg2+浓度和MSG浓度。此外，A和C之间的交互作用显著；A和B、B和C之间的交互作用最不显著；A2、B2和C2曲面效应均显著。
表4 Box-Behnken试验设计及响应值
、
表5响应面模型的方差分析
2.5多因素交互分析结果
使用Design-Expert v.11.0绘制3D Surface响应面模型图，分析不同因素的交互作用影响ectoine积聚量(图4)。综合分析显示，不同两因素交互作用条件下，ectoine的积聚量均呈先升高后降低的变化趋势，峰值不同。NaCl和Mg2+交互作用分析表明(图4A)：当0.08 mol/L MSG浓度时，最高峰值条件为1.0 mol/L NaCl和0.1 mol/L Mg2+。NaCl和MSG交互作用分析表明(图4B)：当0.1 mol/L Mg2+浓度时，最高峰值条件为0.08 mol/L MSG和1.0 mol/L NaCl。Mg2+和MSG交互作用分析表明(图4C)：当1.0 mol/L NaCl浓度时，最高峰值条件为0.1 mol/L Mg2+和0.08 mol/L MSG。使用最优发酵条件组合(NaCl 1.25 mol/L，Mg2+0.09 mol/L，MSG 0.08 mol/L)进行3次重复实验，检测ectoine积聚量(均值696.313 mg/L)，与预测值(701.436 mg/L)非常接近，相对误差小于5%，说明该验证模型有效可行。
图4 NaCl浓度、Mg2+浓度和MSG浓度交互作用
A：NaCl和Mg2+交互作用分析；B：NaCl和MSG交互作用分析；C：Mg2+和MSG交互作用分析
2.6培养基优化前后的发酵效果比较
优化ectoine发酵培养基与初始培养基相比，NaCl和MSG的浓度分别提高为72.5 g/L和15.4 g/L，Mg2+浓度降低为22.2 g/L；优化后菌株ZB109胞内ectoine的积聚量提高了392.693 mg/L(129.34%)，差异极显著(P<0.01)。由此表明，优化培养条件致使菌株ZB109 ectoine的积聚量显著提高。
嗜碱盐单胞菌菌株生理生化与生长特性、最优发酵条件——摘要、材料与方法
嗜碱盐单胞菌菌株生理生化与生长特性、最优发酵条件——结果与分析
嗜碱盐单胞菌菌株生理生化与生长特性、最优发酵条件——讨论、结论