1.2.3健康易感猪筛选
挑选无猪丹毒病流行史，未免疫过猪丹毒相关疫苗，基础体温不高于40℃，精神、采食、被毛、行动均正常的56～63日龄猪30头，采集全血，分离血清，采用竞争ELISA方法和《猪丹毒诊断技术》（NY/T 566—2019）中试管凝集方法同时进行抗体检测。
1.2.4 CVCC43005株对猪最小致死剂量测定
将CVCC43005株菌种用肉肝胃消化汤按照确定的培养条件制备成菌液；根据菌液预数结果，将菌液浓度通过稀释或浓缩的方式调整为3×109、4×109、5×109、6×109、7×109、8×109、9×109、1×1010CFU/mL后，静脉注射56～63日龄健康易感猪；每个剂量组注射2头猪，每头猪注射5 mL；观察4 d，记录猪死亡情况，判定菌种毒力。
1.2.5不同冻干代次CVCC43005株菌种毒力检定
将1986、1996、2006、2015年4个冻干代次的CVCC43005株菌种用肉肝胃消化汤按照确定的培养条件制备成菌液后，每个代次菌种静脉注射56～63日龄健康易感猪2头，每头猪注射最小致死剂量，观察4 d，记录猪死亡情况。同时，每个代次菌种皮下注射18～22 g小鼠5只，每只小鼠注射10 CFU活菌，观察7 d，记录小鼠死亡情况。同时对菌液进行复数，根据复数结果计算猪和小鼠实际注射的活菌数。
1.2.6不同冻干代次CVCC43005株菌种免疫原性检定
用小鼠进行免疫原性检定。参照《规程》将1986、1996、2006、2015年4个冻干代次的CVCC43005株菌种分别制备成灭活抗原。取100只16～18 g小白鼠分为12组。第1～4组，每组10只，分别皮下注射4个冻干代次菌种制备的灭活抗原0.1 mL；第5～8组，每组10只，分别皮下注射4个冻干代次菌种制备的灭活抗原40%氢氧化铝胶生理盐水4倍稀释液0.2 mL；第9～12组，每组5只，不注射疫苗，作为对照组。免疫21 d后，每个免疫组各取5只小鼠，连同对照组5只小鼠各注射1 000 MLD（Minimum Lethal Dose，最小致死量）CVCC43008强毒菌液，另取5只对照组小鼠注射1 MLD CVCC43008强毒菌液；每个免疫组剩余5只小鼠，连同对照组小鼠5只各注射1 000 MLD CVCC43006强毒菌液，另取5只对照组小鼠注射1 MLD CVCC43006强毒菌液。攻毒后观察10 d，统计保护率。
2结果与分析
2.1 TSA培养基质量评价
3瓶猪丹毒活疫苗活菌计数用参考品活菌计数结果分别为10.0×108、12.4×108、11.0×108CFU/头份，均处于8.5×108～12.5×108CFU/头份范围内，证明该批次TSA培养基适宜猪丹毒丝菌的生长。
2.2 CVCC43005株培养及制备工艺确定
猪丹毒丝菌CVCC43005株用肉肝胃消化汤培养24 h内的活菌数结果见表1。以培养时间为横坐标，以活菌数对数值为纵坐标，得出猪丹毒丝菌CVCC43005株用肉肝胃消化汤培养的生长曲线。结果（图1）显示，CVCC43005株在肉肝胃消化汤中培养16 h时活菌数最高，而后进入稳定期，培养19 h后活菌数迅速下降，菌体大量死亡。
图1猪丹毒丝菌CVCC43005株生长曲线
表1 CVCC43005株活菌数结果
故确定猪丹毒丝菌CVCC43005株菌液制备工艺：将CVCC43005株冻干菌种用1.0 mL肉肝胃消化汤复溶后，取0.5 mL接种于含5%马血清、0.2%绵羊裂解血细胞全血、0.4%葡萄糖的10.0 mL肉肝胃消化汤中，33℃静置培养20 h；取新鲜菌液划线接种于含10%马血清、0.2%绵羊裂解血细胞全血的TSA平板，33℃培养42 h，作为一级种子；从一级种子上选取3个典型菌落接种于含5%马血清、0.2%绵羊裂解血细胞全血、0.4%葡萄糖的10.0 mL肉肝胃消化汤（置于100 mL盐水瓶）中，33℃120 r/min培养12 h，作为二级种子；取2.0 mL二级种子接种含5%马血清、0.2%绵羊裂解血细胞全血、0.4%葡萄糖的100.0 mL肉肝胃消化汤（置于250 mL三角瓶）中，33℃120 r/min培养16 h收获。
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