摘要：为探索副鸡禽杆菌生长特性，比较不同血清型菌株生长特性的差异，采用分光光度法和菌落计数法分别测定副鸡禽杆菌血清A型（221株）、血清B型（0222株）、血清C型（Modesto株）3个参考菌株的生长曲线，对两种方法测定的生长曲线进行比较。结果表明，两种方法绘制的生长曲线差异较大，对数生长期和稳定期菌液OD 600 nm值与活菌数对数之间呈现一元二次多项式回归关系。另外，3个血清型菌株的生长稳定期都比较短暂，各型菌株达到生长高峰的时间和活菌数都有差异。该试验为副鸡禽杆菌生物学特性的比较研究及疫苗的研制奠定了基础。
副鸡禽杆菌（Avibacteriumparagallinarum）原称副鸡嗜血杆菌（Haemophilusparagallinarum），是一种无芽胞的革兰阴性杆菌，兼性厌氧，于固体培养基接种培养时需要5%～10%的CO2环境，最适生长温度为37℃，单个菌落在45°光照下呈蓝色透明状，但随着体外传代次数的增加，菌落色泽将减弱或消失。该菌在体外培养的生长要求苛刻，需要NAD（辅酶Ⅰ）的参与，但不是所有菌型都需要，南非和墨西哥对NAD非依赖性菌株已有报道［1－2］。
该菌是鸡传染性鼻炎的病原菌，主要引起鸡的上呼吸道疾病，表现为鸡的生长停滞和蛋鸡产蛋率下降，且呈世界性分布，可导致严重的经济损失。最常用的Page分型法将副鸡禽杆菌分为A、B、C 3个血清型，Kume法将Av．paragallinarum分为3个血清群Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ群，其Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ群分别相当于Page A型、C型和B型。我国分离株多为A型和B型，C型只有一例报道［3］。该病发生后的治愈率高，但易复发，目前主要采取多价灭活疫苗来控制其发生和传播。
细菌生长曲线的绘制方法主要有分光光度法和菌落计数法两种。分光光度法是通过测定菌液的OD 600 nm值，得出的是菌液中包含的总菌数，该方法的优点是操作简便。菌落计数法得出的是菌液中的活菌数，相对来说要准确得多，但是操作复杂而且耗时、耗力。对于一些细菌两种方法绘制的生长曲线有很好的相关性［4－6］。本研究的目的是在同样的条件下培养3个不同血清型副鸡禽杆菌参考菌株，采用分光光度法和活菌计数法测定菌株的生长曲线，了解其生长特性并比较菌株之间的差异，另外，通过试验评价是否可以用分光光度法的OD 600 nm值来衡量菌液中的活菌数量，为副鸡禽杆菌的生物特性比较研究和疫苗生产提供参考依据。
1材料与方法
1．1材料
1．1．1菌株副鸡禽杆菌A、B、C 3个血清型参考菌株，A型（221株）、B（0222株）和C（Modesto株）由澳大利亚昆士兰州动物研究所Blackall博士惠赠。
1．1．2培养基TSA固体培养基（含0．025 g／L NAD和100 m L／L鸡血清）；TSB液体培养基（含0．025 g／L NAD和100 m L／L鸡血清）。
1．2方法
1．2．1合成引物和PCR扩增根据文献［7］合成扩增副鸡禽杆菌500 bp基因片段的引物序列，对培养的细菌进行PCR检测，判断培养物是否为副鸡禽杆菌。上游引物为：5′－TGA GGG TAG TCT TGC ACG CGA AT－3′，下游引物为：5′－CAA GGT ATC GAT CGT CTC TCT ACT－3′。反应体系为：2×buffer 12．5μL，Taq（5 U／μL）0．5μL，d NTP（2．5 mmol／L）2μL，N1（10μmol／L）1μL，R1（10μmol／L）1μL，样品4μL，灭菌去离子水4μL，总体积为25μL。PCR反应条件为：94℃5 min；94℃45 s，56℃45 s，72℃1 min，进行30个循环；72℃10 min，4℃结束反应。
1．2．2细菌培养将800 m L／L甘油保存的菌种复苏，无菌接种于TSA培养基，于37℃、5%的CO2培养箱中培养24 h～30 h。经PCR验证后挑取单个菌落转接至5 m L TSB液体培养基，于37℃摇振培养12 h，再按1∶60体积比例转接至100 m L TSB中扩大培养，于180 r／min 37℃摇振培养24 h。
1．2．3菌液OD 600 nm值测定和活菌计数每隔1 h～2 h在无菌条件下收获少量菌液，用于测量OD 600 nm值，并用灭菌生理盐水进行梯度稀释后各取3个稀释度的菌液50μL涂布TSA平板，于37℃、5%的CO2培养箱中培养至48 h，然后进行菌落计数，根据稀释倍数和平板上的菌落数来计算活菌数（cfu／m L）。
1．2．4菌液纯检收获菌液的同时取少量菌液进行普通营养琼脂平板划线培养，于37℃培养48 h，观察有无杂菌长出，以判定菌液在培养期间是否被污染。