以葡萄糖、蔗糖、乳糖和可溶性淀粉为碳源分别培养玉米大斑病菌野生型和StSte12基因RNAi阳性转化子，研究碳源对StSte12基因调控玉米大斑病菌菌丝生长和分生孢子发育的影响，为阐明StSte12基因的功能和病菌的致病机制奠定基础。结果表明，StSte12基因对玉米大斑病菌菌丝生长和分生孢子发育均有重要的调控作用，StSte12基因的表达量下降后，菌丝的生长势变弱，颜色变浅，生长速度显著下降，产孢量显著降低。4种供试碳源中，可溶性淀粉对StSte12基因调控菌丝生长和发育的影响最大，蔗糖最小；乳糖对StSte12基因调控分生孢子发育没有显著影响，而其他3种碳源的影响均达到显著水平。
玉米大斑病是由玉米大斑病菌(Setosphaeriaturcica)引起的玉米叶部病害，主要发生在气候冷凉湿润的地区，在严重流行年份减产可达50%以上。StSte12基因(S.turcicaSte12)属于Ste12-like基因，与酿酒酵母(Saccharomycescerevisiae)、稻瘟病菌(Magnaporthegrisea)等真菌的Ste12-like基因有较高的同源性，其转录蛋白StSte12是Fus3/Kss1-homolog途径(又称Pathogenicity MAPK cascad)的主要转录因子，具有典型转录因子所特有的STE homeodomain和ZnF_C2H2锌指结构；将StSte12基因在酿酒酵母ste12缺失突变体中表达时能够恢复该酵母突变细胞缺失的生理特征。近期的研究表明，StSte12基因在玉米大斑病菌中调控附着胞发育，是病菌致病力形成的关键因子之一。但StSte12基因对玉米大斑病菌生长和孢子发育的调控作用，以及该调控作用是否受不同碳源的影响尚不明确。本研究拟以玉米大斑病菌StSte12基因的RNAi(RNA interference)阳性转化子及其野生型菌株为试验材料，分析蔗糖、葡萄糖、可溶性淀粉和乳糖4种碳源对菌丝生长、菌落形态和分生孢子发育的影响，阐明碳源对StSte12基因功能的影响，分析影响StSte12基因功能的可能营养物质及其代谢途径，为深入研究玉米大斑病菌StSte12转录因子的调控机制奠定基础。
1材料和方法
1.1材料
1.1.1菌株玉米大斑病菌野生型菌株01-23(WT)和StSte12 RNAi阳性转化子(StRNAi 3-6和StRNAi 9-10)，由河北农业大学真菌毒素与植物分子病理学实验室保存。StRNAi 3-6和StRNAi 9-10的StSte12基因表达量分别为野生型菌株的38%和67%。
1.1.2基础培养基配方：土豆200 g、葡萄糖20 g、琼脂15 g、去离子水1 000 mL。
1.1.3化学试剂葡萄糖、蔗糖、可溶性淀粉、乳糖等化学试剂均为国产化学纯。
1.2试验设计
分别用等量的供试碳源代替基础培养基中的葡萄糖，研究不同碳源对玉米大斑病菌野生型菌株及StSte12 RNAi阳性转化子(StRNAi)菌丝生长和孢子发育的影响，每个处理重复8次。供试培养基碳源为：葡糖糖、蔗糖、可溶性淀粉和乳糖。
1.3试验方法
将在PDA平板培养基上25℃条件下生长7 d的试验菌株菌盘(直径8 mm)接种于不同碳源培养基平板(直径90 mm)的中心，25℃恒温、黑暗条件下培养8 d，每天测量菌落直径，以培养时间为横坐标、菌落直径为纵坐标绘制菌丝生长曲线，计算菌丝生长速率，菌丝生长速率(mm/d)=菌落直径(mm)/培养时间(d)，取第4～8天菌丝生长速率的平均值作为各处理的平均菌丝生长速率(V)；以WT为对照，计算StSte12 RNAi阳性转化子的菌丝生长抑制率(I)，I=(VWT-VStRNAi)/VWT×100%。观察并记录菌落形态和菌丝特征。收集培养8 d时的菌丝和分生孢子，显微观察菌丝和孢子形态，利用血球计数板统计分生孢子数量。
1.4数据分析
采用Excel 2013、SPSS统计软件对试验数据进行系统处理与分析。
2结果与分析
2.1碳源对StSte12基因调控玉米大斑病菌菌丝生长速度的影响
由图1可以看出，野生型菌株和StSte12 RNAi阳性转化子在4种碳源培养基上均能生长，并且在8 d的培养时间内，一定程度上菌落直径随培养时间呈线性增加(R2>0.99)，在4种碳源培养基上StSte12 RNAi阳性转化子的生长速度均低于野生型菌株01-23(图1)。以野生型菌株为对照，计算StSte12 RNAi阳性转化子的菌丝生长抑制率(图2)，结果发现，StSte12 RNAi阳性转化子StRNAi 3-6的菌丝生长受抑制程度显著高于StSte12 RNAi阳性转化子StRNAi 9-10(P<0.05)，并且抑制程度受到碳源种类的显著影响。可溶性淀粉对转化子StRNAi 3-6的抑制率(31.4%)显著高于其他3种碳源(平均26.5%)，而葡萄糖、乳糖和可溶性淀粉等3种碳源对转化子StRNAi 9-10的抑制率(平均14.1%)极显著高于蔗糖(1.5%)。以蔗糖为碳源时，StRNAi 9-10的菌丝生长速率与野生型菌株01-23没有显著差异(P>0.05)。以上试验结果表明，StSte12基因的表达水平与菌丝生长速率有关，即StSte12基因调控着玉米大斑病菌菌丝的生长，但其调控作用受环境中的碳源种类影响，对于StSte12基因表达水平较低的转化子StRNAi 3-6，不同碳源之间的影响差异显著，而对于StSte12基因表达水平较高的转化子StRNAi 9-10，不同碳源之间的影响差异极显著。4种碳源中，总体上可溶性淀粉的影响最强，蔗糖的影响最弱。
A.葡萄糖；B.乳糖；C.蔗糖；D.可溶性淀粉
图1玉米大斑病菌野生型菌株和StSte12 RNAi阳性转化子的菌落生长曲线
A.葡萄糖,B.乳糖,C.蔗糖,D.可溶性淀粉；*表示P<0.05，**表示P<0.01
图2碳源对StSte12基因调控玉米大斑病菌菌丝生长速度的影响