2结果与讨论
2.1菌株的分离及活性筛选
本实验以N－乙酰基甲硫氨酸作为分离培养基中的唯一碳氮源。从来自氨基酸类化工厂附近的8份土样中，分离了约500株菌，并对其进行了D－氨基酰化酶活力的初筛与复筛，得到了酶活力及稳定性均较好的菌株A55，酶活力达到70U，并对其进行后续研究。
2.2菌株A55的鉴定结果
2.2.1形态学特征及生理生化特征（表1）
表1菌株A55的生理生化特征
菌株A55在LB固体培养基上生长迅速，菌落圆形呈淡黄色，表面湿润，中心凸起，边缘整齐；在分离固体培养基上生长相对缓慢，菌落点状呈乳白色，表面湿润，边缘整齐。革兰氏染色阳性，杆状，链状排列。
2.2.2 16SrDNA序列分析
PCR扩增得到的菌株A55的16SrDNA序列全长为1 416bp，将该序列与GenBank数据库中细菌及古菌的16SrDNA序列进行Blast分析。结果表明，菌株A55与耐寒短杆菌相似度最高，达到100%，通过Mega5.2软件得到了以16SrDNA序列为基础的系统发育树（图1）。
由图1可知，菌株A55与耐寒短杆菌Brevibacterium frigoritolerans处于同一分支，亲缘关系最近，结合形态学及生理生化特征可以确定菌株A55为耐寒短杆菌。
2.3菌株A55发酵条件的优化
2.3.1培养条件的确定
图1菌株A55的系统发育树
温度及培养基pH值对微生物的生长有着非常重要的影响，摇床转速及摇瓶装样量主要影响微生物的供氧，也是发酵中不可忽视的因素。考察了培养温度、培养基初始pH值、摇床转速、装样量对菌株A55生长及酶活力的影响，结果见图2。
图2培养温度（a）、培养基初始pH值（b）、摇床转速（c）及装样量（d）对菌株A55生长及酶活力的影响
由图2可知：菌株A55的最佳培养温度为30℃，在此温度下，菌体的生长情况及酶活力均较好；菌株A55在初始pH值为5的培养基上无法生长，其最适初始pH值为7；菌株A55发酵的最佳摇瓶转速为200 r·min－1，最佳装样量为15%，这与菌株A55严格好氧密切相关。因此，确定菌株A55适宜的培养条件为：培养温度30℃，培养基初始pH值7，摇瓶转速200r·min－1，摇瓶装样量15%。在此条件下继续考察其它因素的影响。
2.3.2菌龄对菌株生长及酶活力的影响
菌株A55所产的D－氨基酰化酶属于诱导酶，只有在培养基中添加N－乙酰基氨基酸作为诱导物时，菌株才能合成D－氨基酰化酶。菌株A55的生长曲线及菌龄对酶活力的影响见图3。
图3菌株A55的生长曲线（a）及菌龄对酶活力的影响（b）
由图3a可知，由于种子培养基与发酵培养基相同，菌株A55调整期非常短暂，很快进入对数期，在第8h即进入稳定期。由图3b可知，菌株A55在36～60h之间D－氨基酰化酶活力较高，第72h活力明显降低，可以判断菌株A55从第60h开始进入衰亡期。因此，确定菌株的最佳培养时间为48h，酶活力达到82.99U。
2.3.3碳、氮源对菌株生长及酶活力的影响
分别添加1%的葡萄糖、蔗糖、淀粉、甘油，0.5%的硝酸钠、硫酸铵、尿素、蛋白胨，以发酵培养基为对照，考察不同碳、氮源对菌株A55的生长及酶活力的影响，结果见图4。
图4碳源（a）和氮源（b）对菌株A55生长及酶活力的影响
由图4a可知，在培养基中分别添加不同碳源后，菌株A55的菌体量均明显增加，葡萄糖的影响尤其突出，菌体量增加至对照的2.08倍；然而D－氨基酰化酶活力均明显降低。由图4b可知，硝酸钠、硫酸铵及尿素等无机氮源对菌株A55的菌体量影响不大，D－氨基酰化酶活力有所降低；相比之下，蛋白胨的添加使菌株A55的菌体量增加至对照的2.78倍，同时蛋白胨对D－氨基酰化酶活力影响也较大，使其降低至对照的24.67%。表明，培养基营养丰富反而抑制D－氨基酰化酶的合成，这与该酶属于诱导酶密切相关。
3结论
从氨基酸类化工厂附近土样中分离出产D－氨基酰化酶的菌株A55，通过形态学观察、生理生化特征测定及16SrDNA系统发育分析，鉴定其为短杆菌属的耐寒短杆菌，具有D－氨基酰化酶活力的耐寒短杆菌此前未见报道。另外，对该菌株的发酵条件进行了初步优化，其最佳产酶发酵条件为：培养温度30℃，培养基初始pH值7，摇床转速200r·min－1，摇瓶装样量15%，培养时间48h。为实现国内D－氨基酰化酶的商品化及酶法合成D－氨基酸的工业化奠定了基础。