4-羟基-2,5-二甲基-3(2H)-呋喃酮(4-hydroxy-2,5-dimethyl-3(2H)-furanone,HDMF),商品名称为呋喃酮,又名草莓酮或菠萝酮,广泛分布于自然界中,如在草莓、菠萝、橙桔、黑莓、葡萄、芒果、覆盆子等水果中都有检测出HDMF。另外,在牛肉清汤、新烤面包、炒杏仁、炒榛子、葡萄酒、白兰地酒、爆玉米花、咖啡、木材和烟等众多产品中也有HDMF的发现。

影响微生物合成HDMF的因素众多,按其内因和外因主要包括微生物菌种本身的基因特性和其培养发酵条件[61]。微生物菌种本身特性主要通过从不同环境中筛选、基因诱变或基因改造获得优良菌种而得到改善,而一旦菌种确定后就需要通过调控其培养条件,如碳源种类和浓度、氮源种类和浓度、盐浓度、初始pH值、摇床转速、培养温度、接种量、培养时间等因素对其合成HDMF产量进行调控。


1、糖种类及其浓度


不同的糖种类对微生物合成HDMF会产生不同的影响。在前期研究中认为,酵母合成HDMF的前体物质是FDP,如DAHLEN T等[38]利用同位素标记法证明,HDMF是鲁氏酵母利用FDP产生的次级代谢产物。随着对微生物合成HDMF研究的深入,后续研究表明,除FDP外,麦芽糖、乳糖、鼠李糖、D-果糖等也是微生物合成HDMF的前驱物质,促进HDMF的生成。如张海林[43]探究了葡萄糖、FDP、果糖、乳糖、鼠李糖和麦芽糖等不同碳源对酵母合成HDMF的影响,结果表明,虽然以FDP为碳源时最有利于酵母合成HDMF,但果糖、鼠李糖和麦芽糖也能促进酵母合成HDMF;同样,在王鹏霄[41]研究中也证明了鼠李糖、麦芽糖和果糖都是酵母菌发酵产HDMF的有效前体。另外,糖浓度会对酵母合成HDMF产生一定影响,较高的糖浓度会对微生物细胞产生一定的渗透压胁迫,从而促进EMP和PPP中相关酶活性的提高,增加HDMF的生成[62]。如在周亚男[39]研究中发现,在不同浓度的FDP下酵母所产HDMF量有所不同,在0~120 g/L的FDP质量浓度范围内,随着培养基中FDP浓度的增加,酵母菌所产HDMF的能力呈现先升高后下降的趋势;HECQUET L等[37]研究发现在FDP含量为10%时,鲁氏酵母所产HDMF较高,而当其含量增加至20%时,其合成HDMF的能力则受到一定程度的抑制;DAHLEN T等[38]研究发现FDP浓度与HDMF浓度及酵母细胞数量呈正相关。


2、氮源种类及其浓度


有研究表明,美拉德反应的产物可以促进微生物生成HDMF。由此可以推测氮源对微生物合成HDMF具有重要的影响。如在无氮源的L-鼠李糖溶液中接种荚膜毕赤酵母发酵后未检测到HDMF,而将L-鼠李糖加入到含有蛋白胨的培养基中进行湿热灭菌后,再接种荚膜毕赤酵母发酵后则检测出HDMF,可见氮源会影响微生物合成HDMF[63]。然而,在张海林[43]研究中却发现,不同种类的氮源对酵母NTG-SX-103合成HMDF的影响较小,这可能是由于其所采用的初始培养基为麦汁,其中含有比较丰富的氮源的缘故。虽然有关氮源种类及其浓度对微生物合成HDMF的研究较少,但从其对微生物生长繁殖及其对微生物生物酶的调控和表达以及可能通过美拉德反应形成微生物合成HDMF的前体物质等方面分析,氮源种类及其浓度一定会对微生物合成HDMF产生影响。


3、NaCl和Ca2+质量浓度


有研究表明,在盐胁迫培养条件下会增加EMP中各代谢产物含量及其相关基因的表达,继而会影响微生物合成HDMF[64]。如周亚男[39]研究发现,随着发酵培养基中NaCl浓度的增加,鲁氏酵母合成HDMF的能力呈现先上升后下降趋势,当NaCl质量浓度为180 g/L时,酵母所产HDMF浓度最高;HAUCK T等[51]研究结果也表明,在NaCl含量为17%时有利于微生物合成HDMF。另外,有研究表明,Ca2+是一种渗透压传递信使,一定浓度的Ca2+有助于微生物合成HDMF,如有研究发现在培养基中添加1 mol/L Ca2+有助于酵母合成HDMF,其产量相比未添加Ca2+的培养基增加了23.3%,并且在0~1 mol/L范围内,HDMF的产量随着Ca2+浓度的增加而提高[43];DAHLEN T等[38]探究了酵母在含有不同浓度CaCl2的培养基中生长和产HDMF的情况,结果表明,在CaCl2质量浓度为10~50 g/L时有助于促进酵母合成HDMF。


4、初始pH值


pH值对微生物的生长有多方面影响,主要是通过影响关键酶酶活、微生物细胞膜所带电荷状态等,从而影响微生物对营养物质的吸收和新陈代谢。每种微生物都有其最适生长pH值和一定的生长pH值范围以及所产代谢产物的最佳pH值,适宜的初始pH值有利于促进微生物生长代谢和产代谢产物。如彭辉等[31]研究发现,鲁氏酵母QOR6在不同的初始pH值条件下所产HDMF含量有所不同,随着发酵液初始pH值的增加(由3.7增加至5.7时),其所产HDMF的量呈现先升高后降低趋势,在初始pH值为4.2时,产量最高,为2.18 mg/L;HAUCK T等[51]的研究结果也同样证实了初始pH值对微生物合成HDMF具有较大的影响。


5、摇床转速


摇床转速会影响培养基中营养物质与微生物细胞的接触、氧气传递效率以及对微生物细胞的剪切力,从而影响微生物生长代谢,对HDMF的合成产生影响。彭辉等[31]研究表明,转速对酵母合成HDMF也具有较大的影响,随着转速的增加,发酵液中HDMF含量呈现先上升后下降趋势,在转速为180 r/min时最高,适当的转速为其生长提供了充足的氧气;同样,在HECQUET L等[37]研究中也充分证明了相比厌氧发酵而言,有氧发酵更有利于其合成HDMF。


6、培养温度


培养温度会对酵母生长和代谢产生重要的影响,从而影响到其合成HDMF的能力,而不同的微生物其发酵合成HDMF的最佳培养温度会有所不同。如毕赤酵母菌株P3发酵产HDMF的最佳培养温度为34℃,其产量相比在38℃时提高了50%以上[41];而酵母QOR6的最佳发酵温度则为28℃,显著高于其他温度条件下发酵HDMF产量[31]。研究表明,发酵温度主要是通过影响微生物生物酶活性来调控其产HDMF的量,温度过低或过高都会影响到微生物代谢途径中合成HDMF的生物酶活性[65]。


7、接种量


接种量能调节微生物的生长代谢,适宜的接种量对微生物代谢产物的积累具有积极影响[66]。彭辉等[31]研究表明,随着接种量的增加,鲁氏酵母QOR6合成HDMF的产量先升高后降低,不同接种量之间存在着差异;周亚男[39]研究也发现,接种量会对酵母产HDMF产生一定影响;张海林[43]研究发现,接种量对酵母NTG-SX-103产HDMF影响不显著,这可能是与其所选用的接种量水平相关,在其所选用的不同接种量水平下,发酵后期酵母菌体浓度都没有太大的差异,从而导致HDMF含量差异不明显。


8、培养时间


培养时间不同,微生物代谢过程中相关生物酶的表达水平有所差异,对微生物合成HDMF会产生影响,因此,需要选择合适的培养时间[62]。如LI X等[40]在探索添加D-果糖条件下酵母合成HDMF的分子机制时发现,在发酵等3天时,HDMF的合成主要是通过EMP产生,而在第5天时,EMP和PPP则都是生成HDMF的主要途径,且HDMF含量达到最大;周亚男[39]在探究培养时间对微生物生成HDMF的影响时,均发现HDMF的含量随着发酵时间的增加先上升后下降,分别在第4天、7天和6天时HDMF含量达到最大。


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