桑黄（Phellinus baumii.）是一种食药用真菌，利用沸水可提取其子实体抑菌成分。通过选取乳制品中常见的、具有代表性的有害指示菌，研究了不同浓度的桑黄水提物对革兰氏阳性菌、阴性菌，霉菌和酵母的抑制作用。研究发现：桑黄水提物在1—10 mg/mL作用浓度下，实现了对牛乳中有害细菌、真菌有效的抑制，能显著控制巴杀牛乳中菌群总数的变化，同时对有益菌无显著影响，相对Nisin等抑菌剂具有广谱抑菌性。
随着国民经济的不断提高，我国乳品行业已步入了快速发展时期，消费市场对乳制品的品质要求也在不断提高。开发针对不同消费人群的、具有特殊生理功能的高品质乳制品成为我国乳业发展的一个新方向。而目前国内外乳品微生物污染事故频发，如2000年日本雪印旗下三款产品检出金黄色葡萄球菌超标，2002年美国惠氏生产的乳粉被检出阪崎杆菌超标等［1］。由于乳制品中含有丰富的营养成分，包括蛋白质、脂质、乳糖、维生素等，在乳制品的生产流通以及储存过程容易受到微生物的污染。因而，抑菌问题成为开发特色高品质乳制品重要的环节之一。
乳制品的抑菌方式主要有内源成分抑菌和外源物质添加抑菌［2］。如目前研究最深、应用最广的是乳酸链球菌肽（Nisin），Nisin能有效地控制食品中的有害细菌［3］，特别是耐热的芽孢杆菌及梭菌的生长和繁殖，以达到延长不同乳制品货架期的目的。Nisin能够有效控制革兰氏阳性菌的生长繁殖，但对革兰氏阴性菌、酵母以及霉菌不具有抑制作用［4-5］。因而，与乳制品内源性抑菌物质相比，外源添加抑菌成分有作用范围小、不具广谱抑菌性的弊端。开发一种天然、安全的外源抑菌成分应用于乳制品的抑菌具有重要的意义。
桑黄（Phellinus spp.）作为一种珍贵的传统食药用真菌，是国际认同的食品领域中相率最高的一种食药用真菌［6-7］。目前，对于桑黄子实体水提物的生物活性有诸多报道，如抗氧化［8］、抗肿瘤［9］、抗衰老、提高免疫力、抗纤维化、抗肺炎［10-13］等功效。本研究通过研究桑黄子实体水提物的抑菌性，并应用于乳制品，考察桑黄子实体水提物对保鲜乳中菌群总数的影响，旨在为开发一种天然、安全、性能佳的乳制品抑菌剂做部分基础工作。
1材料与方法
1．1原料与仪器
PDA培养基、肉汤培养基购于国药集团，按药品说明取固体粉末加去离子水溶解后，121℃灭菌15 min后，待用；MRS培养基、M17培养基购于德国默克公司，按药品说明取固体粉末溶解后，121℃灭菌15 min后，待用；指示菌：大肠杆菌（Escherichia coli）、宋内氏志贺氏菌（Shigella Castellani）、沙门氏菌（Salmonella）、单增李斯特菌（Listeria monocytogenes）、金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）、藤黄微球菌（Micrococcus luteus）、枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）、青霉（Penicillium candidum）、白霉（Geotrichum candidum）、酵母菌种（Saccharomyces cerevisiae）保加利亚乳杆菌（Lactobacillus bulgaricus）、嗜热链球菌（Streptococcus thermophilus）以及双歧杆菌（Bifidobacterium），以上菌种保存于光明乳业股份有限公司菌种库；桑黄（Phellinus baumii.）保存于中国微生物菌种保藏中心上海食用菌分中心。
Bioscreen全自动生长曲线分析仪，购于芬兰Bioscreen公司；高压蒸汽灭菌锅HVE-50，购于HIRAYAMA公司；超净工作台TH-CB-402，购于LABCONCO公司。
1．2桑黄水提物的制备
将桑黄菌种栽培得到子实体后，将子实体粉碎至约1 cm3的颗粒，在干燥的子实体粉碎物中加入20倍体积的去离子水，沸水提取2 h，滤得残渣进行二次提取；合并两次提取液并进行浓缩，4 000 r/min离心10 min去除沉淀；将乙醇加入浓缩液中，至乙醇终浓度为90%，室温下静置24 h后，将离心后沉淀部分加去离子水溶解，再次离心去除不溶物质；将上清进行透析12 h，透析后溶液进行冷冻干燥，即得桑黄水溶性提取物，115℃灭菌15 min后使用。
1．3革兰氏阴性菌抑制试验
抑菌方法参照ZHAO［14］并稍作改动。取桑黄水提物分别用无菌去离子水配制成0.5 mg/mL、1 mg/mL、5 mg/mL、20 mg/mL、50 mg/mL溶液，待用；取大肠杆菌、宋内氏志贺氏菌、沙门氏菌分别进行菌种复苏后，将菌体接种于液体肉汤培养基37℃下振荡培养18 h，调节培养后菌液中菌种浓度为105—106个/mL，取1 mL调节后菌液与呈液态的肉汤琼脂培养基混合均匀后倒至培养皿中；待培养基凝固后，将20μL不同浓度桑黄水提物溶液滴在混有有害微生物的固体培养基上，以20μL无菌水作为对照组；37℃下静置培养48 h后测量平板抑菌圈大小。
1．4革兰氏阳性菌抑制试验
抑菌方法参照ZHAO［14］并稍作改动。取桑黄水提物分别用无菌去离子水配制成0.5 mg/mL、1 mg/mL、5 mg/mL、20 mg/mL、50 mg/mL溶液，待用；取单增李斯特菌、金黄色葡萄球菌、藤黄微球菌以及枯草芽孢杆菌分别进行菌种复苏，其余步骤参照“1.3革兰氏阴性菌抑制试验”。
1．5霉菌抑制试验
参照文献［15］的方法，并略做改动。将灭菌后桑黄水提物与PDA培养基混合均匀，使桑黄水提物终浓度为0.1 mg/mL、1 mg/mL、10 mg/mL，倒入平板凝固后，以空白PDA固体培养基为对照；取青霉、白霉菌株分别进行活化并进行固体扩大培养，7 d后分别挑取青霉、白霉菌种于平板中心，30℃培养7 d后，分别测量青霉、白霉在平板中的直径。
1．6酵母生长抑制试验
取啤酒酵母菌种进行复活，挑取活化后的酿酒酵母扩大培养，调节酵母菌体浓度为105—106个/mL并取180μL酵母发酵液与20μL桑黄水提物溶液均匀混合，置于Bioscreen10×10孔板，使样品终浓度分别为4 mg/mL、20 mg/mL、40 mg/mL，以无菌水作为空白对照，30℃连续震荡，宽波长于600 nm吸光度，间隔20 min读数，连续测定2 000 min。
1．7巴氏杀菌乳菌群总数的控制
将灭菌后的桑黄水提物与新鲜牛乳混合均匀，使样品在牛乳中的终浓度为0 mg/mL、0.5 mg/mL、1 mg/mL、5 mg/mL，均质后进行巴氏杀菌，置于10℃下保存，按国标“GB 47892—2010食品安全国家标准”方法测定牛乳中细菌总数，连续测定2周。
1．8有益菌的影响
抑菌方法参照ZHAO［14］并稍作改动。取桑黄水提物分别用无菌去离子水配制成1 mg/mL、10 mg/mL、50 mg/mL溶液，待用；取保加利亚乳杆菌（MRS培养基）、嗜热链球菌（M17培养基）以及双歧杆菌（MRS培养基）三种有益菌株复苏扩大培养，其余步骤参照“1.3革兰氏阴性菌抑制试验”。
不同浓度的桑黄水提物对乳制品中有害指示菌的生长抑制作用（实验仪器与方法）
不同浓度的桑黄水提物对乳制品中有害指示菌的生长抑制作用（实验结果与结论）