桑黄(Phellinus baumii.)是一种食药用真菌,利用沸水可提取其子实体抑菌成分。通过选取乳制品中常见的、具有代表性的有害指示菌,研究了不同浓度的桑黄水提物对革兰氏阳性菌、阴性菌,霉菌和酵母的抑制作用。研究发现:桑黄水提物在1—10 mg/mL作用浓度下,实现了对牛乳中有害细菌、真菌有效的抑制,能显著控制巴杀牛乳中菌群总数的变化,同时对有益菌无显著影响,相对Nisin等抑菌剂具有广谱抑菌性。
随着国民经济的不断提高,我国乳品行业已步入了快速发展时期,消费市场对乳制品的品质要求也在不断提高。开发针对不同消费人群的、具有特殊生理功能的高品质乳制品成为我国乳业发展的一个新方向。而目前国内外乳品微生物污染事故频发,如2000年日本雪印旗下三款产品检出金黄色葡萄球菌超标,2002年美国惠氏生产的乳粉被检出阪崎杆菌超标等[1]。由于乳制品中含有丰富的营养成分,包括蛋白质、脂质、乳糖、维生素等,在乳制品的生产流通以及储存过程容易受到微生物的污染。因而,抑菌问题成为开发特色高品质乳制品重要的环节之一。
乳制品的抑菌方式主要有内源成分抑菌和外源物质添加抑菌[2]。如目前研究最深、应用最广的是乳酸链球菌肽(Nisin),Nisin能有效地控制食品中的有害细菌[3],特别是耐热的芽孢杆菌及梭菌的生长和繁殖,以达到延长不同乳制品货架期的目的。Nisin能够有效控制革兰氏阳性菌的生长繁殖,但对革兰氏阴性菌、酵母以及霉菌不具有抑制作用[4-5]。因而,与乳制品内源性抑菌物质相比,外源添加抑菌成分有作用范围小、不具广谱抑菌性的弊端。开发一种天然、安全的外源抑菌成分应用于乳制品的抑菌具有重要的意义。
桑黄(Phellinus spp.)作为一种珍贵的传统食药用真菌,是国际认同的食品领域中相率最高的一种食药用真菌[6-7]。目前,对于桑黄子实体水提物的生物活性有诸多报道,如抗氧化[8]、抗肿瘤[9]、抗衰老、提高免疫力、抗纤维化、抗肺炎[10-13]等功效。本研究通过研究桑黄子实体水提物的抑菌性,并应用于乳制品,考察桑黄子实体水提物对保鲜乳中菌群总数的影响,旨在为开发一种天然、安全、性能佳的乳制品抑菌剂做部分基础工作。
1材料与方法
1.1原料与仪器
PDA培养基、肉汤培养基购于国药集团,按药品说明取固体粉末加去离子水溶解后,121℃灭菌15 min后,待用;MRS培养基、M17培养基购于德国默克公司,按药品说明取固体粉末溶解后,121℃灭菌15 min后,待用;指示菌:大肠杆菌(Escherichia coli)、宋内氏志贺氏菌(Shigella Castellani)、沙门氏菌(Salmonella)、单增李斯特菌(Listeria monocytogenes)、金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)、藤黄微球菌(Micrococcus luteus)、枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)、青霉(Penicillium candidum)、白霉(Geotrichum candidum)、酵母菌种(Saccharomyces cerevisiae)保加利亚乳杆菌(Lactobacillus bulgaricus)、嗜热链球菌(Streptococcus thermophilus)以及双歧杆菌(Bifidobacterium),以上菌种保存于光明乳业股份有限公司菌种库;桑黄(Phellinus baumii.)保存于中国微生物菌种保藏中心上海食用菌分中心。
Bioscreen全自动生长曲线分析仪,购于芬兰Bioscreen公司;高压蒸汽灭菌锅HVE-50,购于HIRAYAMA公司;超净工作台TH-CB-402,购于LABCONCO公司。
1.2桑黄水提物的制备
将桑黄菌种栽培得到子实体后,将子实体粉碎至约1 cm3的颗粒,在干燥的子实体粉碎物中加入20倍体积的去离子水,沸水提取2 h,滤得残渣进行二次提取;合并两次提取液并进行浓缩,4 000 r/min离心10 min去除沉淀;将乙醇加入浓缩液中,至乙醇终浓度为90%,室温下静置24 h后,将离心后沉淀部分加去离子水溶解,再次离心去除不溶物质;将上清进行透析12 h,透析后溶液进行冷冻干燥,即得桑黄水溶性提取物,115℃灭菌15 min后使用。
1.3革兰氏阴性菌抑制试验
抑菌方法参照ZHAO[14]并稍作改动。取桑黄水提物分别用无菌去离子水配制成0.5 mg/mL、1 mg/mL、5 mg/mL、20 mg/mL、50 mg/mL溶液,待用;取大肠杆菌、宋内氏志贺氏菌、沙门氏菌分别进行菌种复苏后,将菌体接种于液体肉汤培养基37℃下振荡培养18 h,调节培养后菌液中菌种浓度为105—106个/mL,取1 mL调节后菌液与呈液态的肉汤琼脂培养基混合均匀后倒至培养皿中;待培养基凝固后,将20μL不同浓度桑黄水提物溶液滴在混有有害微生物的固体培养基上,以20μL无菌水作为对照组;37℃下静置培养48 h后测量平板抑菌圈大小。
1.4革兰氏阳性菌抑制试验
抑菌方法参照ZHAO[14]并稍作改动。取桑黄水提物分别用无菌去离子水配制成0.5 mg/mL、1 mg/mL、5 mg/mL、20 mg/mL、50 mg/mL溶液,待用;取单增李斯特菌、金黄色葡萄球菌、藤黄微球菌以及枯草芽孢杆菌分别进行菌种复苏,其余步骤参照“1.3革兰氏阴性菌抑制试验”。
1.5霉菌抑制试验
参照文献[15]的方法,并略做改动。将灭菌后桑黄水提物与PDA培养基混合均匀,使桑黄水提物终浓度为0.1 mg/mL、1 mg/mL、10 mg/mL,倒入平板凝固后,以空白PDA固体培养基为对照;取青霉、白霉菌株分别进行活化并进行固体扩大培养,7 d后分别挑取青霉、白霉菌种于平板中心,30℃培养7 d后,分别测量青霉、白霉在平板中的直径。
1.6酵母生长抑制试验
取啤酒酵母菌种进行复活,挑取活化后的酿酒酵母扩大培养,调节酵母菌体浓度为105—106个/mL并取180μL酵母发酵液与20μL桑黄水提物溶液均匀混合,置于Bioscreen10×10孔板,使样品终浓度分别为4 mg/mL、20 mg/mL、40 mg/mL,以无菌水作为空白对照,30℃连续震荡,宽波长于600 nm吸光度,间隔20 min读数,连续测定2 000 min。
1.7巴氏杀菌乳菌群总数的控制
将灭菌后的桑黄水提物与新鲜牛乳混合均匀,使样品在牛乳中的终浓度为0 mg/mL、0.5 mg/mL、1 mg/mL、5 mg/mL,均质后进行巴氏杀菌,置于10℃下保存,按国标“GB 47892—2010食品安全国家标准”方法测定牛乳中细菌总数,连续测定2周。
1.8有益菌的影响
抑菌方法参照ZHAO[14]并稍作改动。取桑黄水提物分别用无菌去离子水配制成1 mg/mL、10 mg/mL、50 mg/mL溶液,待用;取保加利亚乳杆菌(MRS培养基)、嗜热链球菌(M17培养基)以及双歧杆菌(MRS培养基)三种有益菌株复苏扩大培养,其余步骤参照“1.3革兰氏阴性菌抑制试验”。
不同浓度的桑黄水提物对乳制品中有害指示菌的生长抑制作用(实验仪器与方法)
不同浓度的桑黄水提物对乳制品中有害指示菌的生长抑制作用(实验结果与结论)
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