酱香型白酒堆积发酵过程中的真菌群落极为丰富，涵盖了多个真菌门和属。据研究，子囊菌门在酱香型白酒的堆积过程中占据了主导地位，其相对丰度高达95%以上。此外，还有包括担子菌门、接合菌门等在内的其他真菌门也被检测到。在属水平上，更是存在数百个真菌属，其中一些属的相对丰度在堆积过程中超过了1%。
这些真菌群落的存在，为堆积发酵过程提供了丰富的酶系和代谢产物，对于白酒的品质和风味具有重要影响。它们能够分解原料中的淀粉、蛋白质等大分子物质，产生多种有机酸和酯类物质，这些物质是白酒香气和风味的主要来源。
酱香型白酒堆积酒醅的优势真菌及演替规律
为探究导致真菌群落多样性随时间序列变化的微生物原因，进一步分析了堆积过程中微生物结构的演替规律。堆积过程中的优势真菌属（平均相对丰度>1%）有毕赤酵母属（Pichia，平均相对丰度82.75%）、酿酒酵母属（Saccharomyces，5.75%）、嗜热子囊菌（Thermoascus，2.75%）、曲霉属（Aspergillus，2.25%）和红曲霉属（Monascus，1.12%）等。毕赤酵母是酒类发酵过程中常见的非酿酒微生物，具有产酯的作用，对白酒的风味有重要贡献[22]。酿酒酵母是十分重要的乙醇产生工业微生物，直接关系到其发酵酒精的产量多少和质量的好坏。堆积过程中毕赤酵母和酿酒酵母的比例持续增加，堆积结束时毕赤酵母占据绝对优势（86.95%~94.98%）。以上结果暗示了非酿酒酵母对酱香型白酒造沙轮次的发酵群落构建起到重要作用[23]。此外，4个班组微生物演替的总体趋势一致，但仍存在明显差异。我们推测这可能是由于酱香型白酒目前仍然采用传统的酿造方式，各班组的工艺参数控制主要依靠工人师傅的生产经验，这也导致堆积酒醅理化指标的差异；这种由工艺参数控制引起的环境压力差异也会对堆积过程中不同来源的微生物筛选产生差异。因此，即使在酱香型白酒生产的核心产区，仍然出现酿造微生物的差异及发酵质量的波动。
尽管堆积发酵过程中霉菌比例较低，但多样化的霉菌能够产生木聚糖酶、淀粉酶、蛋白酶及酯化酶等酶类[24]，是酿酒生产前期降解发酵原料中淀粉等大分子物质的主要动力[25]。除此之外，霉菌生长代谢过程中还产生一些呈香物质，对产酒具有积极的贡献。值得关注的是，本研究中酵母菌的多样性低于与WU等[21]报道的关于酱香型白酒酵母菌多样性。我们推测产生这种差异的原因可能是本研究为酱香型白酒的造沙轮次，取样季节为冬季，较低的温度导致参与发酵的微生物种群多样性较低，也说明不同季节的环境微生物对酒醅中真菌种群结构都有较大影响[26]。基于酱香型白酒多轮次的发酵工艺，不同轮次的环境微生物群落特征还有待进一步解析，环境微生物如何影响不同轮次发酵质量也有待进一步研究。
酱香型白酒生产用大曲和环境真菌群落的结构分析
由图1环境样品的聚类图可知，大曲、室内环境（室内走廊、堆积地面、工具和窖池地面等）与室外环境（室外地面和车间窗台等）的真菌微生物群落分布具有明显的差异。其中，嗜热子囊菌属（Thermomyces）、嗜热丝孢菌属（Thermoascus）和曲霉菌属（Aspergillus）在大曲中占主导地位；而毕赤酵母（Pichia，<1%）和酿酒酵母（Saccharomyces，<0.1%）的相对丰度非常低，平均丰度均小于1%，属于稀有微生物种类。相比之下，毕赤酵母以工具表面和室内地面为主，其次是假丝酵母属（Candida）、有孢圆酵母属（Torulaspora）和威克汉姆酵母属（Wickerhamomyces）。从微生物分布来看，发酵相关真菌在不同环境中的分布更广泛和普遍，工人的微生物主要是假丝酵母属（Candida）和毕赤酵母属（Pichia）；堆积地面和工具中含有较多的发酵相关的酵母类微生物，可能是环境影响发酵过程的关键类群。未鉴定的微生物和其他非发酵微生物在空气和室外地面样品的丰度更高。以上结果表明，环境样品中微生物的相对丰度存在较大的差异，进一步体现了发酵环境的复杂性和多变性。
酱香型白酒堆积酒醅、大曲及环境样品的真菌群落比较
酱香型白酒生产用大曲中显著富集的真菌微生物
进一步分析酱香型白酒堆积酒醅、大曲和环境样品中的真菌结构。图2-a展示了与环境样品相比，在大曲中显著富集的真菌微生物（大曲OTUs）。如图所示，大曲中显著富集了70种真菌OTU（紫色圆圈表示），占优势的OTU归属于扣囊复膜孢酵母（Saccharomycopsis fibuligera）、紫色红曲霉（Monascus purpureus）、伯顿丝孢毕赤氏酵母（Hyphopichia burtonii）、丝毛红曲菌（Monascus pilosus）和Rasamsonia composticola等，表明大曲对这些微生物群落高度的选择。我们进一步计算了大曲中显著富集的OTU总相对丰度，结果揭示了这些微生物在堆积酒醅、大曲和环境样品的显著差异，大曲中显著富集的微生物在酒醅、环境和大曲中的平均相对丰度分别为3.10%、3.90%和44.19%（图2-b）。最后，解析了大曲中显著富集微生物的属水平分类信息（图2-c），结果表明大曲中显著富集的微生物包括扣囊复膜孢酵母属（Saccharomycopsis）、红曲霉属（Monascus）、嗜热子囊菌属（Thermoascus）以及曲霉属（Aspergillus）等。
酱香型白酒堆积酒醅中显著富集的真菌微生物
堆积发酵的酒醅同时从大曲和环境中富集真菌微生物。图2-a展示了堆积酒醅从环境和大曲中显著富集的真菌微生物共16种。这些显著富集的优势OUT归属为库德毕赤酵母（Pichia kudriavzevii）、酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）、酿酒酵母/奇异酵母（Saccharomyces CF.cerevisiae/Paradoxus）和嗜热子囊菌（Thermoascus crustaceus）等。通过计算这些OTU的总相对丰度，发现他们在各类样品中的分布为大曲中9.05%，环境中14.43%，堆积酒醅中85.06%（图2-b）。进一步分析酒醅中显著富集的真菌OTU的属水平分类信息（图2-c），结果表明，这些微生物主要属于酵母类的微生物如毕赤酵母和酿酒酵母等，并且这些微生物在环境中的比例远远大于在大曲中的比例。以上结果表明酵母类的微生物主要通过环境自然接种并参与发酵过程，表明环境在酱香型白酒的固态发酵过程中的重要作用。
酱香型白酒堆积发酵酒醅微生物的溯源分析
使用贝叶斯概率工具SourceTracker[20]来计算发酵酒醅中的微生物的来源和比例。不同班组的堆积起始的酒醅中真菌微生物具有相似的来源，主要包括大曲（平均贡献比例33.14%）、堆积地面（平均贡献比例37.49%）和工具（平均贡献比例29.22%）等。但不同车间之间微生物来源的比例略有差异：大曲微生物对发酵酒醅的贡献比例为15%~47%，堆积地面贡献比例为27%~43%，而工具贡献比例为15%~41%。其他的环境类别包括室内地面、封窖泥、室外环境、原料、工人和空气等对堆积起始酒醅微生物结构的影响较小。
SourceTracker软件还预测了堆积发酵酒醅中功能真菌的来源，其中堆积发酵酒醅中最丰富的酵母属最常见来源是堆积地面和工具。堆积发酵过程中富集了较多的毕赤酵母。Pichia kudriavzevii主要由堆积地面（18.6%~33.0%）和工具（9%~35%）共同贡献，贡献比例远大于大曲（2.5%~6.5%）。Saccharomyces cerevisiae主要来自于堆积地面（3%~6.6%）和工具（0.06%~3.5%）。作为非酿酒酵母，毕赤酵母已被证明对酱香型白酒微生物态的塑造具有重要的意义。本研究进一步揭示了酱香型白酒核心产区环境微生物对优质酱香型白酒发酵的独特贡献。
除了酿造环境的接种作用，大曲是堆积酒醅中功能微生物的另一个重要来源。大曲对堆积酒醅主要贡献了嗜热子囊菌（Thermoascus aurantiacus、5%~10%）和阿姆斯特丹曲霉（Aspergillus amstelodami）。这些微生物可能对于堆积过程的糖化发酵起到重要作用，表明大曲贡献了堆积初始糖化的主要功能菌群。
小结：酱香型白酒的酿造环境对真菌群落的构成和变化具有重要影响。不同的酿造环境，如温度、湿度、原料组成等因素，都会影响真菌群落的生长和繁殖。此外，酿造环境中的微生物群落也会影响真菌群落的构成和变化。例如，在堆积发酵过程中，细菌群落的构成和变化也会影响真菌群落的生长和繁殖。因此，在酱香型白酒的酿造过程中，需要合理控制酿造环境，确保真菌群落的正常生长和繁殖。