研究简介：抗生素耐药性是一项全球性挑战，对全世界人类健康构成日益严重的威胁。污水处理厂中ARGs的来源和归宿在活性污泥工艺中得到了深入研究。由于活性污泥中细菌密度高和生物多样性丰富，污水处理厂更容易发生ARG转移。然而，关于活性污泥细菌中ARG转移的研究很少。重金属是污水处理厂常见的污染物，已有研究证明金属离子的影响关于ARG的共轭转移。有研究表明Ag(I)、Zn(II)和Cr(VI)，在环境相关和亚抑制浓度下，促进了大肠杆菌菌株之间的ARG转移。然而这些研究主要集中在特定细菌之间的ARG转移，而忽略了作为废水中ARGs的港湾和放大器的活性污泥细菌。在亚抑制水平上，很少研究这些重金属如何影响ARG的转移。漂浮状态下ARG转移的研究主要通过传统烧瓶进行（Jutkina et al.,2016)，工作量大，时间长，操作复杂。很难同时在多种条件下进行交配分析。幸运的是，全自动生长曲线分析仪（Bioscreen C）可以进行高通量实验来解决现有的问题，它可以自动并行运行200个实验条件的两个孔板，为同时在不同条件下进行交配实验提供了一种新方法。由于活性污泥中微生物群落的多样性可能与细菌传播ARG的可能性以及活性污泥中存在的众多机会性病原体有关，因此有必要了解ARG传播到污水处理厂中高度敏感的潜在物种的潜力。在本研究中，计算机培养箱(Bioscreen C)和流式细胞仪结合评估六种环境相关金属（Cu(II)、Zn(II)、Cd(II)、Pb(II)、As(V)和Hg(II))影响ARG转移。研究分析了转接合子的质粒转移频率、系统发育组成和微生物代谢功能，以评估不同金属对ARG转移的影响。
Bioscreen全自动生长曲线分析仪的应用
使用全自动生长曲线分析仪（Bioscreen C，Finland）来估计供体和受体细菌的单个金属的半抑制浓度（IC 50）。对不含重金属（对照）或补充有不同浓度的CuSO 4、ZnSO 4、CdCl 2、Pb（NO 3）2、NaH 2 AsO 4或HgCl 2的合成废水介质进行抑制测定。将5μL混合菌液和295μL培养基注入孔板（每孔体积为300μL），每个样品重复三次。之后，将平板孵育48 h在25°C下中速，自动读数器每60分钟记录一次OD 600值，持续48小时。
实验结果：研究表明重金属可以刺激抗生素抗性基因的转移(ARGs)之间的细菌。然而以往的研究大多集中在纯菌株，重金属的影响关于ARG在细菌群落，特别是活性污泥中的转移，还没有明确的探索。本研究开发了一种结合全自动生长曲线分析仪(Bioscreen C)和流式细胞仪的高通量方法。评价不同浓度重金属对污泥菌群中ARG转移的影响。以大肠杆菌(Escherichia coliMG1655)为供体，对广谱IncP-1质粒pKJK5进行鉴定0.5 mmol/L Pb、0.1 mmol/L As和0.005 mmol/LHg能明显促进污泥细菌中ARG的转移。
图1、合成废水下供体和受体的IC 50值
图2、不同浓度Cu(II)、Zn(II)、Cd(II)、对大肠杆菌MG1655和活性污泥菌的剂量-响应生长抑制曲线。
图3、不同浓度Pb(II)、As(V)和Hg(II)对大肠杆菌MG1655和活性污泥菌的剂量-响应生长抑制曲线。
图4、在不同的金属胁迫条件下，通过共聚焦激光罐形显微镜(CLSM)观察48h后ARG转移到活性污泥菌的芯片上。红点是供体细胞，绿点是转接合子。
图5、对Ck(不含重金属对照)和不同重金属胁迫条件下转接合子池前25个属的共轭电位进行了分析。
总结：本论文研究评估了六种不同浓度的重金属对污泥细菌群落中ARG转移的影响。研究人员开发了结合Bioscreen C全自动生长曲线分析仪和流式细胞术的高通量方法来进行交配测定和转接合子计数。结果表明重金属，包括0.5 mmol/L Pb(II)、0.1 mmol/L As(V)和0.005 mmol/L Hg(II)，可以促进污泥细菌群落中的ARG转移。与对照相比，转移频率增加了1.25到2倍。此外，将微流控芯片应用于培养附着细菌，证明上述重金属促进了ARG转移。假单胞菌、气单胞菌、肠杆菌和埃希氏菌-志贺氏菌是转接合子的优势属，由于其丰度高且有可能接受ARG编码的质粒，因此应引起关注。转接合子的功能预测表明与重金属抗性相关的ABC转运蛋白最为丰富。该研究进一步了解重金属对污泥细菌群落中ARG转移的影响，这对于评估和控制污水处理厂中的ARG具有重要意义。
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