土壤微生物能分解和合成有机物，参与全球元素循环，它们能够以互利共生的方式活跃于植物根表，形成结构复杂的根际微生物群落，影响植物营养吸收和健康［1］。这些聚集于根际的微生物群落形成了植物“第二基因组”［2-3］。根际微生物与植物的关系类似于肠道微生物与人体的关系［4］。植物能通过根际分泌物以及免疫系统物质调节根际微生物群落的构成，而根际微生物也能通过代谢活动参与到植物的生长发育、养分吸收和胁迫响应等过程［1］。尽管越来越多的根际微生物被研究，揭示出有促生与生防功能，但根际微生物与植物建立的作用关系是否长久稳定，仍不清楚。
随着人们对过度施用化肥引起的生态环境问题的重视，农业绿色持续发展的关注，包括尿素、二胺等氮肥过剩引起的土壤元素不平衡、植物徒长、果实品质低和水体污染、富营养化，甚至诱发大气中氮氧化物等温室气体含量增加等问题［5］。在农业生产中，替代如氮肥等化肥，减轻其引起的环境问题，已经刻不容缓。微生物研究者关注到根际微生物的潜在价值，凭借微生物的固氮作用，探究施用菌剂替代氮肥的可行性。雷海英等［6］采用阿须贝氏（Ashby）无氮培养基，从苦参的根际土中筛选到2株根际固氮菌，分别隶属于芽孢杆菌属和假单孢菌属，将菌剂添加到苦参幼苗中，生长30 d后显示出添加菌剂增加了植株的株高和叶片数，促进了植物幼苗生长。薛智权等［7］采用Ashby无氮培养基筛选到2株具有固氮能力的细菌，黄芪种子分别经2种菌液浸泡后种植，与未浸泡菌液的对照相比，株高分别增加了17.8%和64.4%，叶片数也显著增加。程杰杰等［8］研究分离自玉米根际的固氮菌株对玉米和水稻的促生效果，结果显示，施用菌液对玉米和水稻的生长具有促进作用。然而，筛选的根际促生细菌是否能够稳定地促进植物生长，或者频繁地施加促生菌菌剂是否会对植物产生负效应，却鲜有报道。
番茄（Lycopersicon esculentum）属于管状花目茄科番茄属，是世界上价值较高的水果和蔬菜［9］。我国是世界上最大的番茄生产和消费国家之一，2021年我国番茄产量达6 609万t，在蔬菜作物中位居榜首［10-11］。我国番茄种植方式已从露天种植逐步转向大棚设施内，提质、增效和集约化管理、生物防治、减肥减药的原则逐渐深入人心［10］。探究施用根际细菌对番茄生长的影响，具有推动番茄健康发展的重要意义。笔者采用Ashby无氮培养基从番茄根际土中筛选根际固氮菌，研究根际细菌对番茄幼苗根系及生长的影响，揭示根际细菌在番茄栽培中的应用潜力与风险。
1材料与方法
1.1试验材料
菌株筛选于番茄根际土壤，该土壤样品为2022年3月采集于山西农业大学东阳试验基地大棚内结果期番茄植株根际。
盆栽试验供试番茄品种为晋番茄四号；栽培基质采用蛭石；栽培花盆的规格为直径12.0 cm×高12.5 cm×底径10.0 cm。
1.2培养基
LB液体培养基：胰蛋白胨10.0 g，酵母浸出粉5.0 g，NaCl 10.0 g，一次水定容至1 000 mL，pH 7.0～7.4。121℃高压蒸汽灭菌21 min备用。
LB固体培养基：胰蛋白胨10.0 g，酵母浸出粉5.0 g，NaCl 10.0 g，琼脂16.0 g，一次水定容至1 000 mL，pH 7.0～7.4。121℃高压蒸汽灭菌21 min备用。
阿须贝氏（Ashby）无氮培养基：甘露醇10.0 g，KH2PO4 0.2 g，NaCl 0.2 g，CaSO4·2H2O 0.1 g，CaCO3 5.0 g，MgSO4·7H2O 0.2 g，琼脂15.0 g，一次水定容至1 000 mL，pH 6.8～7.0。
1.3菌株筛选与鉴定
称量采集的番茄根际土1 g，将土样置于含有玻璃珠的锥形瓶中，添加99 mL无菌水，然后37℃、170 r/min振荡30 min，获得土壤悬浊液。取悬浊液1 mL，使用梯度稀释法，稀释为10-1、10-2、10-3、10-4、10-5、10-6浓度的悬浊液。然后每一浓度吸取200μL涂布到Ashby无氮培养基平板上。上述过程重复３次。37℃恒温培养48 h，观察菌落的大小、颜色、边缘、光泽、透明度等。使用接种环挑取不同形态的菌落，分别在新的Ashby无氮培养基平板上反复纯化，挑取单菌落反复纯化至少7次。将纯化的菌株接种到LB固体培养基斜面和Ashby无氮培养基斜面上，置于4℃冰箱保存以供下一步使用。另添加20%甘油若滴，保存于-80℃冰箱内。该过程最终筛选获得5株菌株，分别命名为F1、FN1、FN2、FN3、FN6。
菌株鉴定采用16S rDNA的分子鉴定方法。收集1 mL OD600为1.0～1.5的细菌菌液，离心弃上清后加入含有酶RNase A的缓冲液，加入溶菌酶，室温静置5 min，反复离心、冲洗与水浴，提取细菌的基因组DNA。采用引物27F和1492R（5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′和5′-CTACGGCTACCTTGTTACGA-3′）进行PCR扩增。反应体系为基因组DNA 1.0μL，10×Buffer（含Mg2+）5.0μL，Taq聚合酶1.0μL，dNTP 1.0μL，正反引物各1.5μL，补充ddH2O至50.0μL。程序为95℃预变性5 min，然后95℃变性30 s，58℃退火30 s，72℃延伸1.5 min，进行35个循环，最终72℃延伸7 min。按照AxyPrep DNA凝胶回收试剂盒说明书进行PCR产物的回收。使用ABI3730-XL测序仪进行DNA测序，将测序结果与NCBI核酸数据库进行比对，获得物质序列相似性最大的物种信息，作为鉴定结果。
1.4菌液的制备
使用接种环分别挑取在LB固体培养基平板上活化的5株菌株的单菌落，接种至250 mL LB液体培养基中，重复3次。30℃170 r/min恒温振荡培养3 d，获得菌液。将重复培养获得的菌液混合摇匀，用于盆栽试验。
1.5盆栽试验
自2023年2月12日至3月28日，在山西农业大学玻璃温室内进行盆栽试验，以自然光为光照条件，温度维持在15～35℃，湿度维持在40%～65%。采用完全随机设计，以番茄作为供试植物，分别添加筛选到的菌株F1、FN1、FN2、FN3、FN6菌液作为处理，添加未接种菌株的培养液作为对照CK，设置6个重复，每盆保留2株植株，共36盆。
挑选外形大小一致且饱满的番茄种子，用75%乙醇溶液浸泡5 min进行消毒，然后使用蒸馏水冲洗3次，再将种子浸泡在含有无菌水的培养皿内。栽培基质选取蛭石，先采用高压蒸汽灭菌法121℃、90 min进行灭菌，然后晾干。花盆使用75%乙醇进行消毒。在每个花盆中装入灭菌的蛭石500 g，然后将番茄种子点播到蛭石表面2 cm以下，每盘点播3粒。采用称重法保持含水量为80%。10 d出苗后，保留长势一致的植株，每盆间苗为2株，每盆浇灌Hogland营养液20 mL。继续种植14 d后，进行施用菌剂处理。分别添加F1、FN1、FN2、FN3、FN6菌株制成的菌液和未接种菌株的培养液100 mL，24和34 d后，都再次施用相应的菌液100 mL。44 d后，测量番茄植株的株高、茎粗和SPAD值，然后收获植株。
1.6指标测量
株高的测量使用精度为1 mm的直尺；茎粗的测量使用精度为0.01 mm的游标卡尺；SPAD值的测量使用叶绿素仪SPAD-502 Plus（Konnica Monlta，日本）。
鲜重的测量使用精度为0.01 g的电子天平称量植株的地上部和根系；干重的测量使用烘箱70℃对测完鲜重的植物样品烘干2 d，再使用精度为0.000 1 g的电子天平称量。
根直径、根总长、根总面积和根总体积的测量使用根系扫描仪Epson Twain Pro（Epson，日本）对平铺的植物根系进行扫描，然后使用根系形态学和结构分析软件WINRhizo分析计算；地上部投影面积的测量同样使用根系扫描仪Epson Twain Pro对平铺的植物地上部（包括叶片和茎）进行扫描，然后使用软件WINRhizo分析计算。
1.7数据统计分析
分别将5种菌株处理的指标与对照的指标进行t检验分析，统计结果P<0.05标记*，P<0.01标记**。统计分析使用软件SPSS 16.0进行。