2结果与分析
2.1贝莱斯芽胞杆菌WB的生长促进能力分析
对WB菌株分泌IAA的能力进行测定，结果显示，其水平从0到36 h呈上升趋势，在36 h达到(129.73±8.73)μg/mL的峰值，随着菌株生长进入衰亡期，其分泌IAA的水平也随之下降(图1A)。如图1B所示，WB菌株和CK之间的总氮含量有显著差异，表明WB菌株具有固氮能力。
如图1C~1E所示，WB菌株能够在产纤维素酶、解磷和解钾培养基上产生透明的圆圈，表明WB菌株具有分解纤维素、解磷和解钾的能力。
2.2贝莱斯芽胞杆菌WB处理对西瓜胚根生长的影响
为探索WB菌株对西瓜植株促生的最适浓度，采用不同浓度的WB菌悬液对已萌发的西瓜种子进行处理，结果显示，与CK相比，不同浓度的WB菌悬液对已萌发的西瓜种子表现出不同的影响。WB菌悬液在不同浓度下对西瓜胚根生长的影响存在显著性差异，在4.0×106 CFU/mL的浓度下对西瓜胚根的促生效果最佳，其次是在4.8×107 CFU/mL的浓度下(图2)。
2.3贝莱斯芽胞杆菌WB对西瓜幼苗生长的促生效应
为进一步验证WB菌株对西瓜幼苗的促生效应，每3 d用WB菌悬液(6.25×106 CFU/mL,40 mL)基因或基因ID处理西瓜幼苗1次，结果表明，经WB菌株处理的西瓜植株高度增加了67.55%(图3A)，茎粗增加了78.41%(图3B)，根干重增加了32.23%(图3C)，根节点数增加了47.19%(图3D)，根长增加了32.35%(图3E)，地上鲜重增加了68.36%(图3F)，说明WB菌株促进了西瓜植株的生长。
表1 用于qRT-PCR分析的基因和引物
2.4差异表达基因及其功能注释
对接种贝莱斯芽胞杆菌WB悬浮液4 d和6 d的西瓜叶片的转录组数据进行分析，结果如图4A所示，与对照组(CK)相比，菌株WB悬浮液处理4 d，共有498个DEGs，其中406个基因上调，92个基因下调。WB菌悬液处理6 d，与对照相比，共有494个DEGs，其中219个基因上调，275个基因下调(图4B)。
利用GO功能注释对DEGs进行功能分类，根据其功能将DEGs分为3大类：生物过程(biologicalprocess)、细胞组成(cellular component)和分子功能(molecular function)。如图5所示，在生物过程类别中，涉及最多的DEGs是细胞过程(GO:0009987)和代谢过程(GO:0008152)；细胞组成的类别中涉及DEGs最多的是细胞部分(GO:0044464)和膜部分(GO:0044425)；分子功能类别中涉及DEGs最多的是结合基因(GO:0005488)和催化活性基因(GO:0003824)。KEGG功能注释分析发现，DEGs主要富集在5个主要类别：细胞过程、环境信息处理、遗传信息处理、代谢系统和生物体系统。
图1 WB菌株促生能力测定
A.WB菌株的生长曲线和分泌IAA的能力。B.WB菌株固氮能力。**：差异极显著(P＜0.01)；下同。C.WB菌株产纤维素酶能力。D.WB菌株的解钾能力。E.WB菌株的解磷能力
图2 WB菌株不同菌悬液浓度对西瓜胚根生长的影响
图3 B.velezensis WB处理对西瓜幼苗生长的影响
A.株高。B.茎粗。C.根干重。D.根节点数。E.根长。F.鲜重。*：差异显著(P＜0.05)；下同
图4贝莱斯芽孢杆菌WB处理和CK西瓜植株间差异基因的火山图
A.菌株WB处理西瓜植株4 d。B.B.velezensis WB处理西瓜植株6 d。下同
图5贝莱斯芽孢杆菌WB处理和CK西瓜植株间差异基因的GO功能注释
WB4 vsCK4处理中最突出的前4个KEGG过程包括：萜类和聚酮类的代谢(map00904)、碳水化合物的代谢(map00040)、氨基酸的代谢(map00270)和信号转导(map04016,map04070和map04075)。代谢系统途径包含最多的DEGs(72.82%)，其次是环境信息处理(9.71%)。在WB6 vs CK6处理中发现脂质代谢(map01040)也是DEGs富集的重要途径。68.97%的DEGs富集在代谢系统的路径中，12.07%的DEGs富集在环境信息处理的路径中(图6)。
2.5 KEGG富集分析
对WB4 vs CK4处理中的DEGs进行KEGG富集分析，如图7所示，DEGs主要富集在与植物生长相关的一些途径中。9个基因富集在苯丙烷类生物合成途径中，6个基因富集在植物激素信号途径中。
此外，4个基因在半萜和三萜类化合物的生物合成途径中富集。WB6 vs CK6处理中有6个基因富集在苯丙烷类生物合成途径中，6个基因富集在植物激素信号途径中，2个基因富集在半萜和三萜类化合物的生物合成途径中。这些结果表明，贝莱斯芽胞杆菌WB处理影响了西瓜植物中促进植物生长途径的基因表达。
2.6贝莱斯芽胞杆菌WB诱导半萜和三萜类化合物及苯丙烷类生物合成途径上的基因表达
半萜和三萜类化合物的生物合成途径与植物生长有关。苯丙烷生物合成途径也参与植物生长。表2中的数据结果表明，WB4 vs CK4处理中参与半萜和三萜类化合物的生物合成途径和苯丙烷类生物合成途径的基因被不同程度地上调。例如，与CK4相比，3个编码香叶烯D(germacrene D,GERD)的基因(Cla97C10G190 250,Cla97C10G190240和Cla97C10G190260)上调了1.65~2.70倍。编码橙花叔醇合成酶1(nerolidol synthase1,NES1)的基因上调了2.24倍。苯丙氨酸解氨酶(phenylalanine am‐monia-lyase,PAL)是苯丙氨酸生物合成途径中的一个关键酶。与CK6处理的西瓜植株相比，PAL相关的基因在WB6处理的西瓜植株中被上调了1.70倍。
编码植物咖啡酸-O-甲基转移酶(caffeic acid Omethyltransferase,COMT)和ß-葡萄糖苷酶(β-Glu‐cosidase)的基因分别上调了2.18和3.00倍。过氧化物酶是苯丙烷类生物合成途径中的一个关键酶。
图6贝莱斯芽孢杆菌WB处理和CK西瓜植株间差异基因的KEGG功能注释
图7贝莱斯芽孢杆菌WB处理和CK间西瓜植株差异基因的KEGG富集分析
与CK4相比，2个过氧化物酶相关基因(Cla97C09G177290和Cla97C11G207220)上调了1.30和1.76倍。与CK6相比，3个过氧化物酶相关的基因(Cla97C02G049930,Cla97C04G070210和Cla97C 02G045070)被上调了1.07~1.89倍(表2)。
总之，贝莱斯芽胞杆菌WB不同程度地上调了半萜和三萜类化合物的生物合成途径和苯丙烷生物合成途径的基因。
2.7贝莱斯芽胞杆菌WB诱导西瓜的植物激素信号转导和植物-病原体互作通路IAA是存在于植物中的一种常见的重要植物激素，能促进植物的生长发育，植物激素信号转导是合成IAA的重要信号途径，对植物生长有重要的促进作用。WB4 vs CK4处理中编码IAA的3个基因(Cla97C07G140170,Cla97C06G117070和Cla97C11G213210)上调了1.06~1.25倍，编码组氨酸磷酸转运蛋白(Arabidop⁃sis histidine phosphotransfer proteins,AHP)的2个基因(Cla97C06G115080和Cla97C08G155240)分别上调了1.56和1.30倍(表2)。编码A型反应调节子(Arabidopsis response regulator,ARR-A)的基因(Cla97C01G007850)被上调了1.35倍。同样，在贝莱斯芽胞杆菌WB菌悬液处理6 d时，编码IAA和与乙烯有关的基因也出现了不同程度的上调(表2)。编码类钙调素(calmodulin-like,CML)的基因Cla97C02G038500上调了1.26倍。综上，西瓜植株在接种WB菌株后激活了植物信号转导途径中与促进生长有关基因的表达。
表2不同促生长信号通路中DEGs的功能
图8贝莱斯芽孢杆菌WB处理4 d(A)和6 d(B)西瓜植株上调表达的转录因子
2.8贝莱斯芽胞杆菌WB诱导参与植物抵抗西瓜专化型尖胞镰刀菌(Fon)的转录因子的表达转录因子(transcription factors,TFs)是植物生长、发育和胁迫反应的主要调控者。
如图8所示，菌株WB处理4和6 d分别上调了10个转录因子的表达。这些转录因子包括MYB(my‐eloblastosis)、NAC(NAM,ATAF and CUC)、Dof(DNA binding with one finger)、SBP(SQUAMOSApromoter-binding protein)、TCP(teosintebranched lcycloidea proliferating)和ERF(ethylene responsivefactor)等。所有这些转录因子都与植物生长和发育有关，表明WB菌株可以通过上调西瓜中的转录因子的表达来调节西瓜植物的生长。
2.9 qRT-PCR验证
为了验证RNA-seq的数据，本研究对与促生有关的差异基因表达进行了qRT-PCR验证。在RNA-seq数据中，经过验证的基因，包括半萜和三萜类化合物的生物合成途径中的香叶烯D(ger‐macrene D,GERD)基因(Cla97C10G190250)在WB4vs CK4处理中上调了6.14倍，苯丙烷类生物合成途径中的过氧化物酶(peroxidase,E1.11.1.7)基因(Cla97C09G177290)上调了2.08倍，植物与病原体相互作用途径中的CML基因(Cla97C02G038500)和植物激素信号途径中的IAA基因(Cla97C07G140170)分别上调了2.37和1.96倍。对上述4个DEGs的qRT-PCR分析表明，其表达趋势与RNA-seq的结果一致(图9)。
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