2结果与分析
2.1乳酸利用菌的培养结果
将能够在乳酸钠培养基上生长的菌株，根据其菌落特征分为6种不同类型的乳酸利用菌，初步命名为：R-0、R-1、R-2、R-3、R-4、R-5。见表1。
表1筛选乳酸利用菌的菌落和镜检结果
从表1可看出，6株微生物的细胞都是杆状，菌落有所差异。R-0：菌落小、呈椭圆形、表面光滑；R-1：菌落大而粗燥、与培养基结合、不透明、菌落黄色；R-2：菌落小、湿润、表面光滑；R-3：菌落小、表面光滑、菌落呈浅黄色；R-4：菌落白色、小而光滑、边缘齐整；R-5：菌落呈白色、不透明、边缘呈花瓣状。
2.2乳酸利用菌的筛选结果
培养基在灭菌过程中乳酸会有一定的挥发，所以样品灭菌接种后从0 d开始取样。
如表2所示，在有氧且同样培养3 d的条件下，6株菌株对乳酸的利用率基本都是100%。
表2有氧培养3 d各菌株乳酸的消耗量
如表3所示，在厌氧条件下，R-2和R-3菌株对乳酸的利用和其他菌株相比具有优势，R-2和R-3对乳酸的利用率为12.9%和16.0%，R-0、R-1、R-4、R-5对乳酸的利用率为10.4%、12.0%、7.1%、10.6%。
表3无氧培养3 d各菌株乳酸的消耗量
由以上结果分析得出，在有无氧条件下，6株微生物都可以利用乳酸，R-2和R-3菌株在厌氧条件下对乳酸的利用比其他菌株好。微生物在窖池的生长条件大部分都是厌氧的，因此选择R-2和R-3在厌氧条件下利用乳酸最多的菌株进行下一步实验。
2.3葡萄糖对乳酸利用菌的影响结果
如图1所示，在有氧条件下，R-2和R-3分别利用乳酸2.16 g/L（28%）和2.99 g/L（40%），在相同的培养条件下，R-3对乳酸的利用率比R-2高12%；在无氧条件下，R-2和R-3分别利用乳酸0.65 g/L（8.6%）和0.73 g/L（9.7%），R-3对乳酸的利用率比R-2高1.1%。
图1 R-2和R-3有氧无氧下培养3 d乳酸的消耗量及利用率
如图2所示，在有氧条件下，R-2和R-3各利用葡萄糖1.25 g/L（46%）和1.37 g/L（50.7%），R-3对葡萄糖的利用率比R-2高4.7%；在无氧条件下，R-2利用葡萄糖0.99 g/L（37%），R-3利用葡萄糖1.13 g/L（42%），R-3对葡萄糖的利用率比R-2高5%。
图2 R-2和R-3有氧无氧下培养3 d葡萄糖的消耗量及利用率
由上所述，R-2和R-3在葡萄糖存在时同样可以利用乳酸，R-3比R-2在葡萄糖存在时对乳酸的利用更好。
2.4 pH值耐受性测的结果
如图3所示，将R-2和R-3在34℃条件下培养3 d，R-3菌株在初始pH值为6.5、7.5、8.5时，OD600值都随着时间的延长而上升，初始pH值为8.5时OD600值增长最高，R-3菌株在初始pH值为5.5和9.5时，OD600值随着时间的延长基本没有变化。这表明R-3菌株可以在pH值为6.5～8.5的培养液中正常生长，最适pH为8.5。
图3 pH对菌株生长的影响
与R-3菌株相比，R-2菌株只有在初始pH值为5.5时OD600值基本不变，在初始pH值为6.5、7.5、8.5、9.5时，OD600值都随着时间的延长一直上升，特别是在初始pH值为8.5时OD600值增长最高，这表明R-2菌株可以生长的pH值范围是6.5～9.5，最适生长pH值为8.5。
综上所述，R-2和R-3菌株可以正常生长的pH值范围为6.5～9.5。据报道，窖泥中的pH值在5.86～9.22范围内变化，完全符合这两株乳酸利用菌对pH值的生长需求[15-17]。
2.5乙醇耐受性结果
将R-2和R-3菌株接种于含有乙醇浓度为0%、1%、2%、3%、4%、5%的乳酸钠培养基中，34℃下有氧培养3 d，结果如图4所示。
图4乙醇浓度对菌株生长的影响
R-3菌株在接种后就进入对数生长期，R-2菌株在1 d时才开始进入对数生长期；R-2和R-3菌株在乙醇含量为0%～4%时，OD600值都可以快速增长；在乙醇含量为5%时，2菌株受乙醇的抑制较为明显，OD600值增长较为缓慢。2菌株在乙醇含量为0%～4%可以快速生长，与镇达等[18]研究6株乳酸利用菌对乙醇的耐受性结果基本一致。
结果表明，2菌株都可以耐受5%以下的乙醇含量，R-3比R-2菌株能更快进入对数生长期，说明R-3比R-2菌株能够更快适应生长环境。
2.6菌种鉴定结果
R-3和R-2菌株的16S rDNA扩增产物琼脂糖凝胶电泳结果如图5所示，孔号1是R-3菌株，孔号2是R-2菌株，测序结果在Genbank数据库进行比对，R-2为赖氨酸芽孢杆菌（Lysinibacillussp.），R-3为热带杆菌（Bacillus tropicus）。
由图5可知，R-2和R-3菌株经过PCR扩增得到了高质量的扩增产物，将扩增产物测序，选取相似度高的比对结果使用MEGA6软件构建系统发育树，结果如图6所示。
图5 R-3和R-2菌株的16S rDNA PCR扩增产物琼脂糖凝胶电泳的结果
由图6可知，R-2菌株与芽孢杆菌相似度最高，R-3菌株与热带杆菌相似度最高。
图6 R-2和R-3菌株的系统发育树
3结论
通过对老窖泥的分离筛选，得到了6株能够利用乳酸的菌株。选择R-2和R-3这两菌株在厌氧条件下对乳酸利用较好的微生物进行研究。经分子生物学鉴定R-2为赖氨酸芽孢杆菌（Lysinibacillussp.），R-3为热带杆菌（Bacillus tropicus），R-2和R-3菌株在34℃都可以耐受5%的乙醇含量，R-2菌株pH生长范围是6.5～8.5，R-3菌株pH生长范围是6.5～9.5，最适生长pH都是8.5；在葡萄糖存在时两菌株仍然可以利用乳酸，有氧时，R-3对乳酸的利用率比R-2高12%，厌氧时，R-3对乳酸的利用率比R-2高1.1%。两菌株对白酒降低乳酸乙酯有一定的应用与参考价值。
老窖泥筛选分离的6株乳酸利用菌培养、发酵性能、生长范围（一）
老窖泥筛选分离的6株乳酸利用菌培养、发酵性能、生长范围（二）