雌马酚（equol）是1932年Marrian等在怀孕雌马的尿液中分离羟雌酮时发现的，并确定分子式为C15H14O3。1982年Axelson等在普通人的尿液中发现了雌马酚，还证明人在摄入大豆异黄酮后能在肠道菌的参与下降解产生雌马酚。雌马酚经尿和胆汁排泄，排出浓度存在个体差异，受大豆异黄酮种类、肠道菌群多样性、膳食成分等因素的影响，其中主要取决于肠道微生物菌群的组成及代谢能力。Kenneth等通过对41名青年人包括29名素食者和12名非素食主义者进行了研究，用质谱方法（mass spectrometer，MS）分析血清和尿液中大豆苷元和雌马酚浓度，发现在素食者中雌马酚产生者为59%，比非素食者高出25%。
近些来，对以人粪样为样本分离大豆异黄酮降解菌的研究发展较快，通过对培养条件的优化和控制，获得多种不同代谢特性的厌氧型降解菌，且多为革兰氏阳性杆菌。2007年Uchiyama等成功分离出乳酸球菌20-92、真杆菌7-430和梭菌20-197，能将大豆素（daidzein）直接转化为雌马酚；Jin等在2008年分离得到菌株PUE和DZE，PUE能将葛根素转化为大豆素，DZE能将大豆素和染料木素（genistein）分别转化为Equo和15-OH-equol。Tamura等于2006年分离得到的TM-40菌株，不能直接将大豆素转化为雌马酚，只具有将大豆苷（daidzin）和大豆素转化为双氢大豆素（dihydrodaidzein，DHD）的能力。在前期的研究中，采集了6位女性素食志愿者的粪样作为样本，从中培养分离出LJ-G1和LJ-Q2两株肠道菌，均为厌氧菌，LJ-G1为革兰氏阴性杆菌，LJ-Q2为革兰氏阳性球菌，纯培养均具有代谢大豆异黄酮产雌马酚的能力。
目前雌马酚的体外获得主要通过两种途径，一是将大豆苷元从大豆中提取出后，在催化剂的作用下还原合成雌马酚，另一种是筛选出雌马酚产生菌，进行体外培养，以大豆苷元为底物，从培养液中得到雌马酚。前者成本较高，不利于雌马酚的广泛应用，因此利用微生物发酵法生产雌马酚具有广阔的前景。本研究在前期工作基础上，研究素食者产雌马酚肠道菌生长规律、优化菌株生长条件，为后续菌株降解大豆异黄酮的代谢研究，开发以生物发酵法制备雌马酚提供科学参考。
1材料与方法
1.1菌种与试剂
菌种：LJ-G1和LJ-Q2由黑龙江省高校食品科学与工程重点实验室自素食者粪便分离保藏。
大豆异黄酮（纯度80%）西安市天园生物制药厂；雌马酚标准品（纯度98%）合肥兰旭生物有限公司；BHI肉汤培养基青岛海博生物技术有限公司；琼脂粉上海山医学化验所试剂厂；乳糖、麦芽糖、蔗糖、果糖、葡萄糖天津市化学试剂一厂；硫酸锰、硫酸锌、氯化钙、碳酸钠、硝酸钾吉林宏久试剂厂。
1.2仪器与设备
YQX-Ⅱ型培养箱上海新苗医疗机械有限公司；超洁净工作台上海净化设备有限公司；LDZX-30KBS立式压力蒸汽灭菌器上海申安医疗器械厂；循环水式真空泵巩义市予华仪器有限责任公司；电热恒温鼓风干燥箱上海恒科学仪器有限公司；TU-1900型双光束紫外分光光度计北京普析通用仪器有限公司。
1.3方法
1.3.1添加大豆异黄酮培养基制备及菌种活化
本实验所用器皿均在干燥箱内经150℃、3 h干热灭菌，液态试剂均在压力蒸汽灭菌器内经102.9 kPa，20 min湿热灭菌，无菌操作在超净工作台下完成。
称取9.5 g BHI肉汤培养基溶于250 mL蒸馏水中，调节pH 7.4，加入质量浓度为5 mg/mL的大豆异黄酮溶液，使其终质量浓度为0.75 mg/mL。取保存于斜面的LJ-G1和LJ-Q2菌株，将供试菌种分别接种于BHI肉汤培养基中，置于37℃厌氧培养12 h。取活化好的菌种斜面，用无菌生理盐水配制菌悬液，采用平板计数法调制菌悬液浓度为106～107CFU/mL，备用。
1.3.2肠道菌生长曲线的测定
生长曲线的测定采用活菌计数法。将活化后的菌液接种于装有BHI液体培养基的试管中（n=3），接菌量体积分数5%，在48 h内每隔3 h跟踪测定活菌数，并根据这些实验数据绘制生长曲线，进行分析，以便更好的掌握和利用其生长规律。按公式（1）计算菌数。
式中：S为培养基中总活菌数/（CFU/mL）；X1、X2、X3为同一稀释度菌落数/（CFU/mL）；N为菌落稀释倍数。
1.3.3雌马酚测定方法
雌马酚定量测定采用紫外法，将固体培养基用80%乙醇溶液充分溶解后，活性炭脱色6 h、过滤，用聚酰胺树脂进行纯化，5 h后收集纯化液，以80%乙醇溶液定容，205 nm波长处测定OD值。回归方程为：y=0.174 04x＋0.006 23（R2=0.996 9）。按公式（2）计算培养基中雌马酚含量。
式中：ρ1为培养基中雌马酚质量浓度/（μg/mL）；V1为培养基体积/mL；V2为定容后体积/mL；ρ2为回归方程计算得到的雌马酚质量浓度/（μg/mL）。
1.3.4不同种类的金属盐及其浓度对肠道菌生长的影响
向BHI液体培养基中分别添加MnSO4、ZnSO4、CaCl2、Na2CO3、KNO3溶液，使其浓度（以培养基体积计）分别达到0.1、0.2、0.3、0.4、0.5 mol/L，再将活化后的LJ-G1和LJ-Q2的菌液按体积分数5%接种于BHI液体培养基中，37℃厌氧培养36 h，以只接菌未添加金属盐的培养基作为对照，BHI液体培养基最大吸收波长为460 nm，因而在此波长处测定光密度（OD）值（n=3），考察各金属盐及不同浓度对肠道菌生长的影响。
1.3.5不同碳源对肠道菌的影响
选取葡萄糖、麦芽糖、蔗糖、果糖、乳糖5种碳源，分别添加于BHI培养基中，质量浓度（以培养基体积计）达到10 g/L，以不添加糖为对照。分别接种稀释度为10-5的LJ-G1和LJ-Q2菌液各0.2 mL，倒置放入厌氧箱中，37℃培养36 h后，采用活菌计数法计数（n=3）。
1.3.6生长条件单因素试验
单因素试验主要考虑葡萄糖质量浓度、pH值、NaCl质量浓度这3个因素，在BHI固体培养基上，基础培养条件为葡萄糖质量浓度（以培养基体积计）7 g/L、pH 7、NaCl质量浓度（以培养基计）4 g/L。接种、培养条件、评价指标按1.3.5节操作，考察各因素适宜范围。
1.3.7菌株生长条件正交试验
根据单因素试验结果，采用L9（34）进行正交试验，以雌马酚产量为评价指标，优化生长条件。试验中的各组平行试验结果的差异显著性检验均采用常用的统计方法F检验法。
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