CRISPR系统是原核生物中发现的一种适应性免疫系统，可以保护宿主细胞免受外来DNA的入侵。作为噬菌体和细菌免疫系统之间持续斗争的一部分，CRISPR系统已演变成各种类型，每种类型都具有不同的功能。II型Cas9是这些系统中研究最广泛的，并且具有多种亚型。目前尚不确定该家族的成员是否能够进化出额外的机制来对抗病毒入侵。在这里研究人员鉴定了2,062个完整的Cas9位点，预测其相关蛋白的结构，并揭示了II-C型Cas9的三种结构生长轨迹。我们发现新的相关基因(NAG)往往存在于较大的II-C Cas9的基因座内。进一步研究表明，来自金黄杆菌属的CbCas9含有一个新的β-REC2结构域，并与II-C Cas9(PcrIIC1)的NAG编码的CRISPR–Cas系统促进(pro-CRISPR)蛋白形成异四聚体复合物。
与独立的CbCas9相比，CbCas9-PcrIIC1复合物表现出增强的DNA结合和切割活性、对原型间隔子相邻基序序列的更广泛的兼容性、对错配的耐受性增强以及抗噬菌体免疫力的提高。总体而言，我们的工作在结构水平上揭示了II-C Cas9蛋白的多样性和“生长进化”轨迹，并鉴定了许多NAG，例如PcrIIC1，它作为前CRISPR因子来增强CRISPR介导的免疫。
Bioscreen全自动生长曲线分析仪的应用
Bioscreen C是一种微生物生长曲线分析仪，用于监测大肠杆菌（E.coli）在不同条件下的生长情况，生长条件是在37°C下培养，并每2小时测量一次OD600nm值。Bioscreen C用于测定在体内毒性实验中，含有不同质粒（如表达MBP、SUMO、PcrIIC1或VapC毒素）的E.coli BW25141细胞在葡萄糖抑制蛋白表达或阿拉伯糖诱导蛋白表达条件下的吸光度（OD600nm）随时间的变化。
实验结果
成功制备了机械强度高的MCPC微凝胶，该微凝胶通过酚类金属配位框架稳定，用于益生菌和多酚的共同递送。该微凝胶具有增强的益生菌胃酸保护、肠道响应释放和粘膜粘附特性的组合。棕色生物活性物质天然结合在MCP多糖上，事实证明，MCP多糖是提高阿克曼氏菌丰度的精确益生元。MCPC/AKK通过依次在肠道中提供活性AKK并在肝脏中提供棕色抗氧化剂，有效改善APAP诱导的肝损伤。MCPC微凝胶在肠道中的高活性AKK可以恢复肠道微生物失调并促进SCFA产生，从而增强肝功能，调节氧化应激和炎症，并通过肠肝轴修复肠道屏障。
图1、大型II-C Cas9与邻近的NAG相关并表现出结构生长轨迹。a)示意图显示已识别的II-A、II-B、II-C型和NAG相关II-C系统的CRISPR-Cas9系统的数量。显示了GEM和HBGC数据集中已识别系统的数量。b)具有（NAG+）和不具有（NAG−）NAG的II-C Cas9的蛋白质大小的比较。NAG+的中值为1,463个氨基酸，NAG−的中值为1,159个氨基酸。使用双边检验进行统计分析，并通过曼-惠特尼U检验确定显著性。c)所有已识别的NAG的功能注释。具有核酸结合功能的NAG呈红色。d)示意图显示了II-C Cas9结构预测、量化和降维分析的工作流程。PCA，主成分分析。e)II-C Cas9s蛋白质结构的SGT分析平面。点的大小对应于Cas9的大小，颜色对应于SGT的伪时间。每个簇的标签根据轨迹着色。f)每个轨迹的高级簇中的代表性Cas9结构。NAG+Cas9的比例标记在顶部，不同簇中Cas9的总数标记在每个簇的底部。
图2、CbCas9三元和CbCas9-PcrIIC1四元复合物的冷冻电镜结构。a)CbCas9 PAM偏好。左图是随机质粒去除测定的示意图。右图是CbCas9 PAM偏好的WebLogo图。数据代表具有相似结果的三个独立实验。b)CbCas9域组织的示意图。c)根据b着色的完整R环（左）和部分R环（右）CbCas9三元复合物(CbCas9-sgRNA-dsDNA)的原子模型。HNH和CTH是无序的，不包含在两个模型中。β-REC2中潜在的DNA结合赖氨酸残基在部分R环CbCas9三元复合物中用绿色球体标记。d)CbCas9–PcrIIC1–sgRNA–dsDNA四元复合物（28 bp dsDNA底物）的冷冻电镜图（顶部）和原子模型（底部）。e)由两个对称CbCas9-PcrIIC1效应子结合的两个dsDNA底物（20-nt互补）的卡通图。f)PcrIIC1二聚体和两个CTH结构域的原子模型，以及PcrIIC1和Mg 2+离子的冷冻电镜图（半透明）。与活性口袋中的Mg 2+相互作用的残基以红色显示。g)描述CbCas9的CTH结构域和PcrIIC1的NCP之间结合的局部结构模型。
图3、PcrIIC1增强CbCas9的体外DNA干扰活性。a，CbCas9和CbCas9-PcrIIC1 PAM偏好的WebLogo图。数据代表具有相似结果的三个独立实验。b，热图显示CbCas9-PcrIIC1和CbCas9之间PAM偏好的倍数变化。与CbCas9组相比，较暖的颜色表明CbCas9-PcrIIC1组对PAM的偏好增加。c，CbCas9和CbCas9-PcrIIC1效应子对含有各种PAM（ACAAA、ACAAC和ACGTC）的靶dsDNA进行体外切割的模型（左）和效率图（右）；在0、2、5、15、30、60、90和120分钟时收集等分试样。数据为平均值±标准差（n=3个独立重复）。CbCas9的每个PAM的平台值分别为66.88、46.98和26.77，CbCas9-PcrIIC1的每个PAM的平台值分别为71.84、65.37和53.15。Cb和Cb+P分别表示CbCas9和CbCas9-PcrIIC1效应子。d，使用CbCas9和CTH突变的CbCas9（CbCas9-CTH mut；K1431E、K1433E、K1435E和R1442E）使用ACAAC PAM对目标dsDNA进行的模型（左）和切割效率图（右），在有或没有PcrIIC1的情况下孵育；在0、2、5、15、30、60、90和120分钟时收集等分试样。数据为平均值±标准差（n=3个独立重复）。Cb-CTH mut和Cb-CTH mut+P分别表示CTH突变的CbCas9和CTH突变的CbCas9-PcrIIC1效应子。e，左图，用于目标dsDNA的R环形成的smFRET测定示意图，其中TS上有Cy3标记，NTS上有Cy5标记。右图为仅DNA、PcrIIC1、dCbCas9和dCbCas9-PcrIIC1样品的FRET直方图。
图4：CbCas9-PcrIIC1复合物通过两个CbCas9效应子增强dsDNA筛选和dsDNA入侵能力。a，CbCas9-PcrIIC1-sgRNA-dsDNA非靶向复合物的结构。蛋白质以半透明冷冻电镜图显示，核酸以原子模型显示。b，a中CbCas9-PcrIIC1非靶向复合物的侧视图。B型DNA模拟物显示为半透明模型。c，非靶向复合物中CbCas9-PcrIIC1与dsDNA靶标结合的示意图。d，CbCas9-PcrIIC1-sgRNA-dsDNA（对称20-nt互补）双靶向复合物的结构。蛋白质以半透明冷冻电镜图显示，核酸以原子模型显示。e，双靶向复合物中CbCas9-PcrIIC1结合dsDNA靶标的示意图。f，含有两种不同原型间隔子（原型间隔子-1（红色）和原型间隔子-2（蓝色）的Fam标记的靶dsDNA的体外切割。右下角是不同裂解产物的图表。g，示意图显示CbCas9的单链搜索和CbCas9-PcrIIC1复合物的双链搜索。
图5、通过与MCPC介导的相互作用增强肠道粘膜粘附和益生菌定植。A)粘膜粘附曲线，B)MCPC和MCP对大鼠肠粘膜的最大分离力(MSF)和总粘附功(TAW)。C)MCPC浓度对粘液粘附益生菌影响的菌落计数。D)粘液（用绿色Alexa Fluor 488-WGA标记）渗透无红色和嵌入NZ9000的CLSM 3D图像。E)FITC标记的游离WCFS1或MCPC/WCFS1在胃肠道中的滞留。F)红色游离NZ9000或MCPC/NZ9000在肠粘液中的分布。空肠粘液用绿色Alexa Fluor 488-WGA染色，肠绒毛细胞核用蓝色DAPI染色。G)小鼠粪便中各种AKK的菌落计数。
总结
CRISPR系统是原核生物（如细菌）中的一种适应性免疫系统，能够保护宿主细胞免受外来DNA的入侵，尤其是噬菌体的攻击。研究者们鉴定了2,062个完整的Cas9位点，并预测了其相关蛋白的结构，揭示了II-C型Cas9的三种结构生长轨迹。研究发现新的相关基因（NAG）通常存在于较大的II-C型Cas9的基因座内。特别是来自金黄杆菌属的CbCas9含有一个新的β-REC2结构域，并与PcrIIC1蛋白形成异四聚体复合物。PcrIIC1蛋白是一种无毒的核酸酶，对单链DNA(ssDNA)和单链RNA(ssRNA)具有核酸酶活性，但其生物学作用与典型的PIN域毒素不同。CbCas9-PcrIIC1复合物表现出增强的DNA结合和切割活性，对原型间隔子相邻基序（PAM）序列的更广泛兼容性，对错配的耐受性增强，从而提高了抗噬菌体免疫力。通过冷冻电镜分析，研究者们揭示了CbCas9-PcrIIC1复合物的详细结构，包括它们如何协同作用于长dsDNA底物，以及如何通过双重靶向来增强DNA干扰能力。研究提供了关于II-C型Cas9蛋白从紧凑到大型的进化生长轨迹的新视角，并探讨了这些进化趋势与细菌宿主的进化关系。PcrIIC1蛋白的发现不仅增进了研究人员对细菌免疫机制的理解，而且为CRISPR-Cas9系统在生物技术和医学中的应用提供了新的可能性，尤其是在提高基因编辑精度和适应性方面。研究运用了多种先进的生物信息学工具和实验技术，如AlphaFold2结构预测、冷冻电镜（cryo-EM）和单分子荧光共振能量转移（smFRET）等，来揭示Cas9蛋白的结构和功能。本项研究不仅在结构水平上揭示了II-C Cas9蛋白的多样性，而且鉴定了PcrIIC1这样的新型CRISPR相关蛋白，为理解CRISPR-Cas系统的进化和功能提供了重要信息，并为未来的生物技术应用奠定了基础。