在液体摇床培养试验中,禾谷镰刀菌在卵磷脂、植酸和K2HPO4为唯一磷源的液体培养基中培养7 d后,菌丝生物量的测定结果见表2。不同磷源物质对禾谷镰刀菌菌丝生物量的影响差别很大。以卵磷脂为唯一磷源,菌丝生物量显著高于对照组K2HPO4,说明卵磷脂更有利于禾谷镰刀菌生长,磷浓度为4.38 mmol/L时,卵磷脂菌丝生物量达到0.28 g,而同一磷浓度下K2HPO4组生物量为0.22 g,植酸组生物量为0.23 g。植酸与K2HPO4相比,对禾谷镰刀菌菌丝体生长促进效果不显著,说明植酸与无机磷酸根离子对禾谷镰刀菌生长的有效性相同。同一磷源物质,浓度不同对菌丝生物量也有很大影响。当磷浓度为0.043 8 mmol/L时,卵磷脂菌丝生物量为0.13 g,当磷浓度为4.38 mmol/L时,菌丝生物量可达到0.28 g,菌丝生物量增加了1.2倍。

表2不同磷源条件下禾谷镰刀菌菌丝生物量

注:表中同列数值后不同小写字母表示差异显著(P<0.05,n=3)。下表同


2.2卵磷脂、植酸对禾谷镰刀菌代谢产物的影响


不同有机磷不仅影响禾谷镰刀菌的生长,而且还影响其代谢产物。生测试验结果表明:以卵磷脂、植酸为唯一磷源培养禾谷镰刀菌的发酵培养液对种子的萌发,胚根胚芽生长的抑制作用差异显著(图3)。不同磷源条件下禾谷镰刀菌培养液对玉米种子萌发抑制率、胚根抑制率和胚芽抑制率的影响见表3。卵磷脂的发酵培养液明显强于无机磷K2HPO4对种子生长抑制作用,当磷浓度为43.8 mmol/L时,卵磷脂组对种子的萌发抑制率可达到56.7%,对种子胚根的抑制率可达95.03%,对胚芽的抑制率可达到89.49%;植酸的发酵培养液仅次于卵磷脂但明显强于K2HPO4对种子生长抑制作用,同一磷浓度条件下,植酸组对种子的萌发抑制率可达到43.3%,对种子胚根的抑制率高达88.45%,对胚芽的抑制率可达85.71%。

图3磷浓度为43.8 mmol/L培养液对玉米种子生长抑制情况

A.无磷基础培养基(ck);B.卵磷脂;C.植酸;D.K2HPO4

表3不同磷源条件下禾谷镰刀菌培养液对玉米种子抑制率的影响


当培养基中卵磷脂、植酸和K2HPO4浓度降低时,发酵培养液对种子的生长抑制作用明显减弱,说明禾谷镰刀菌产毒量明显减少。当磷浓度为43.8 mmol/L时,卵磷脂组发酵培养液能抑制50%以上种子萌发,而当卵磷脂浓度降至0.043 8 mmol/L时,发酵培养液对种子萌发已起不到抑制作用(表3),并且对胚根的抑制率从90%以上降至约50%。综上,卵磷脂、植酸较无机磷K2HPO4更能促进禾谷镰刀菌分泌抑制玉米种子生长的物质,并且随着磷浓度升高抑制作用明显增强。


2.3禾谷镰刀菌利用卵磷脂、植酸代谢产物分析


产生毒素是病原真菌侵染寄主植物的主要机制之一,有研究表明,禾谷镰刀菌侵染小麦时产生单端孢霉烯族毒素(Trichothecene mycotoxins),其中以脱氧雪腐镰刀菌烯醇(Deoxynivallenol,DON)及其乙酰化衍生物3-Ac DON和15-Ac DON最为常见,是禾谷镰刀菌危害小麦生长的一个重要致病因子,侵染阶段DON的产量显著高于菌丝生长阶段。另外也有研究表明,添加一定浓度的DON毒素有利于菌株在寄主组织内的定殖和扩展。在镰刀菌侵染植物时,DON可以帮助病菌杀死寄主细胞,提高DON的产量,加速坏死病斑的产生等。这些研究都证实,DON在禾谷镰刀菌侵染过程中发挥作用。但禾谷镰刀菌侵染玉米是否与侵染小麦机制相同,尤其是有机磷是否会诱导禾谷镰刀菌产生该毒素未见文献报道。


通过利用FD-600型荧光免疫定量分析仪对不同磷源培养禾谷镰刀菌的发酵液中代谢产物进行分析,结果见表4。发酵培养液中的抑制玉米发芽以及胚芽、胚根生长的主要物质是脱氧雪腐镰刀菌烯醇,并且发酵液中DON质量浓度随着磷浓度的增加而升高。当培养基中磷浓度分别为0.043 8,0.438,4.38,43.8 mmol/L时,卵磷脂DON的质量浓度分别为90.16,325.11,856.54,978.55µg/L。在磷浓度为43.8 mmol/L条件下,卵磷脂发酵培养液中DON质量浓度最高,为978.55µg/L,植酸次之,为580.79µg/L,二者显著高于K2HPO4培养液中DON的质量浓度104.51µg/L。

表4不同磷源条件下发酵培养液中DON毒素含量


以上研究结果表明,卵磷脂、植酸不仅具有促进禾谷镰刀菌生长的作用,还能显著促进禾谷镰刀菌产生DON毒素。


2.4卵磷脂和植酸对禾谷镰刀菌致病力的影响


为进一步验证禾谷镰刀菌利用有机磷产生DON毒素侵染玉米的致病机制,采用盆栽试验进行验证,结果列见表5。接种不同磷源条件下培养的禾谷镰刀菌到玉米苗的茎部,接种5 d后,与K2HPO4相比,以卵磷脂为唯一磷源培养的禾谷镰刀菌菌丝接种后,玉米苗发病情况更加严重,发病率最高达到98.33%,病情指数为94。其次为植酸培养的菌丝体,发病率最高为90.00%,病情指数为89,两者显著高于无机磷K2HPO4培养的菌丝玉米茎腐病发病率(76.66%,病情指数为72)。说明卵磷脂、植酸具有促进禾谷镰刀菌菌丝产毒代谢和提升致病力的作用,同样在玉米茎腐病的侵染过程中发挥作用。

表5不同磷源培养的禾谷镰刀菌菌丝的致病力


3、讨论


土壤有机磷是土壤磷库的重要组成部分,不同形态有机磷对禾谷镰刀菌的有效性与Bowman-Cole分级体系中有机磷的生物有效性一致。高活性有机磷(磷脂类)具有显著促进禾谷镰刀菌生长的作用;虽然中度活性有机磷植酸与无机磷K2HPO4相比,对禾谷镰刀菌生长促进效果不显著,但这一结果也表明,植酸与无机磷酸根离子对禾谷镰刀生长的有效性相同。由于土壤有机磷较无机磷在土壤中具有更强的移动性,因此有机磷对禾谷镰刀菌的有效性更高,这可能是引起土壤环境中禾谷镰刀菌种群数量变化的重要影响因子。


土壤有机磷种类和含量不仅影响禾谷镰刀菌的生长,还能提升禾谷镰刀菌的致病力,高活性有机磷(磷脂)和中活性有机磷(植酸)较无机磷均可显著提高禾谷镰刀菌致病力。与禾谷镰刀菌侵染小麦时产生脱氧雪腐镰刀菌烯醇(DON)的侵染机制相似,禾谷镰刀菌利用有机磷产生DON毒素侵染玉米,导致玉米茎腐病发生。


由于土壤有机磷组分含量因土壤的母质、类型、特性、质地、植被类型和气候季节等诸多因素的变化以及土地管理措施的不同而有差异,人们的研究结果并不一致:在施肥方面,王静等认为,增施有机肥显著增加土壤中不同组分有机磷的含量,其中土壤活性有机磷和高稳性有机磷增幅最大,其次为中稳性有机磷和中度活性有机磷,但Ahmed等研究表明,使用有机肥显著增加土壤活性有机磷、中度活性有机磷和非活性有机磷含量,其中中度活性有机磷的增幅最大,王飞等研究认为,施磷肥总体提高了高活性有机磷与中等活性有机磷含量,降低了高稳定性有机磷含量,增施磷肥使活性有机磷与中等活性有机磷占有机磷比重增加,高稳定性有机磷比重降低;在土地利用与管理方面,赵小军等认为,各形态有机磷均以免耕秸秆覆盖含量最高,其次为免耕不覆盖、耕作结合秸秆还田,玉米与豆科作物轮作,除中度活性有机磷略有下降外,其他有机磷组分均有所上升,而轮作方式不同主要影响土壤中各形态无机磷及不稳定态有机磷的变化,对土壤稳定态有机磷无影响。可见,生产过程中,由于土壤中有机磷变化而导致禾谷镰刀菌种群数量和侵染能力发生变化,进而引起玉米茎腐病的发生和危害程度存在不确定性。因此,选育和推广玉米茎腐病高抗品种,仍然是东北玉米主产区玉米茎腐病防治的主要措施。



土壤有机磷源卵磷脂和植酸对禾谷镰刀菌菌丝生长和致病力的影响(一)

土壤有机磷源卵磷脂和植酸对禾谷镰刀菌菌丝生长和致病力的影响(二)

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