1.2.4成纤维细胞生长曲线测定
取传至第2代、第4代、第6代的龙陵黄山羊成纤维细胞，胰酶消化后，制成单细胞悬液，调整细胞密度为1×105个/孔，接种于24孔培养板。从第2天开始到细胞长满，每天随机取3孔，连续7 d记数。用血球计数板在倒置相差显微镜下计数，取其平均值，以时间（d）为横坐标，细胞数为纵坐标绘制细胞生长曲线。
1.2.5成纤维细胞的核型检测
取培养至汇合度为85%左右，并处于对数生长期的细胞为实验材料，参照Sun方法进行染色体制备。
1.2.6细胞活率测定
选取龙陵黄山羊第2、4、6代冻存前后的成纤维细胞，分别对细胞进行PI染色，在荧光显微镜下拍照，统计计算细胞存活率。
2结果与分析
2.1龙陵黄山羊成纤维细胞形态学观察
耳缘组织块培养约5 d时，龙陵黄山羊成纤维细胞、少量类上皮细胞从组织块移出生长。随着培养时间的延长，大量成纤维细胞从组织块周围迁出并迅速增殖，成纤维细胞呈长梭形。当细胞长至培养皿（瓶）底壁85%左右时，进行传代培养。细胞进行传代培养后，生长速度加快，3～4 d细胞即可长满瓶底并再次传代。原代细胞及传代后细胞的培养结果见图1。
图1龙陵黄山羊成纤维细胞
2.2龙陵黄山羊耳缘成纤维细胞冻存前及复苏后细胞活率
龙陵黄山羊成纤维细胞第2代、第4代、第6代冻存前活率分别为93.16%、92.58%、92.01%，复苏后活率分别为91.22%、91.06%、90.47%，细胞在冻存前和复苏后都有较高的存活率，均达90%以上，表明成纤维细胞培养条件适宜。另外，冻存对成纤维细胞存活率影响不大。
2.3龙陵黄山羊成纤维细胞生长的动态观察
根据每组每天测得的结果，绘制细胞生长曲线。如图2所示，各代细胞都经历了大约72 h的潜伏期，不同代次的细胞生长曲线均为“S”型。随着传代次数的增加，细胞增值速度有所变慢。
图2龙陵黄山羊成纤维细胞生长曲线
2.4龙陵黄山羊成纤维细胞核型分析
参照Levan等的标准，第3代细胞核型取100个分裂相进行统计分析。结果表明，龙陵黄山羊染色体数为2n=60的所占比例为91.68%，常染色体及X染色体均为端部着丝粒染色体，说明所培养的细胞遗传性能稳定，该细胞系为稳定的二倍体细胞系。
图3龙陵黄山羊核型图（母）（1 000×）
3讨论
进行细胞染色体核型分析时，当山羊的成纤维细胞用终浓度为0.1μg/mL时，秋水仙素处理时间为7～8 h、低渗时间为18～22min。在配制磷酸盐缓冲液时，用钠盐取代钾盐可以得到同样效果，同时降低了成本。据吴帅帅等报道，云岭黑山羊的染色体数目2n=60；叶绍辉等报道，龙陵黄山羊的染色体数目为2n=60。本实验结果表明，龙陵黄山羊的染色体数目为2n=60，与上述结论一致。
通过绘制龙陵黄山羊第2、4、6代细胞生长曲线，可以看出随着细胞传代次数的增加，细胞增殖速度有所减缓。此外，细胞解冻后活率也随着传代次数的增加有所降低。而本实验要求培养的细胞始终维持二倍体生物学性状，保持与体内细胞有较大相似性，因此不能传代太多，传6代细胞不用于实验就立即低温冻存。对第3代细胞中染色体众数进行检测，2n=60的占91.68%，染色体没有异常表现，说明该细胞系为稳定二倍体细胞系。
本研究建立的龙陵黄山羊耳缘组织成纤维细胞系增殖快，遗传性能稳定。此细胞系的建立，不但使龙陵黄山羊这一云南省优良遗传资源在细胞水平上得以保存下来，而且结合其他生物技术，如体细胞克隆或转基因技术，可以加快新品种培育速度，从而提高云南省家畜种质资源创新利用的技术水平，并为相关遗传学研究提供了有效的理论依据和理想的生物材料。同时对于开展其他动物成纤维细胞系的建立也有一定的理论和技术指导意义。