2.4分离株NM575的细胞嗜性
将分离株NM575接种到不同种属的细胞。结果表明在MDBK中最敏感，生长滴度最高，TCID50/mL可达107.6；在BHK、CEF和Marc145中较敏感，TCID50/mL为105.5左右；在PK-15中也可增值，但滴度较低，TCID50/mL为101.7；在Vero-E6中不增殖（图4）。
图4分离病毒株NM575接种不同细胞后的TCID50
2.5分离株NM575的生长曲线
分离株NM575在感染MDBK细胞后，3~24 h内病毒滴度不断上升并达到高峰，24 h后稍有下降，但仍保持在高滴度水平直至本试验结束，即接种后48 h（图5）。
图5分离病毒株NM575的一步生长曲线
2.6 RT-PCR鉴定结果
以分离病毒RNA为模板经反转录制备的cDNA中，用牛肠道病毒引物扩增获得大小为1300 bp左右的特异性目的条带，与设计引物时参考的牛肠道病毒BJ001株（HQ663846）预测的大小相符，初步证明分离株NM575为牛肠道病毒（图6）。
图6分离病毒株NM575 P1基因的PCR鉴定
2.7病毒分离株NM575的序列比对分析及分子进化树的构建
将病毒分离株NM575 P1基因序列与GenBank中登录的牛肠道病毒不同毒株，以及不同种属的肠道病毒参考株的P1序列进行比对，结果表明本研究分离株NM575与牛肠道病毒BEV-261株核苷酸同源率最高，达80%。经MEGA软件分析表明NM575与德国牛肠道病毒分离株BEV-261处于同一分支，证实分离株为牛肠道病毒。对基因序列进一步分析表明分离株NM575血清型属于EV-F，基因型为EV-F1（图7）。
图7病毒分离株NM575的P1基因进化树分析
3讨论
牛肠道病毒属于小RNA病毒科、肠道病毒属，为单股正链RNA病毒。它具有典型的小RNA病毒结构，主要抗原表位也集中在结构蛋白VP1上，但其致病力明显弱于同属的人肠道病毒，所以多年以来并未引起人们足够的重视。牛肠道病毒感染宿主广，易被感染动物排泄在粪便中，滴度较高并且在环境中存活时间较长，对环境及水源的污染较为严重。牛肠道病毒在全世界较为流行，其分离源包括患有牛肺炎和痢疾、呼吸系统疾病及发热、流产、脊髓水肿、腹泻、出血性肠炎等疾病的牛粪便及组织样本，这些都表明牛肠道病毒在一定程度上与一些临床疾病相关。国内已有5株牛肠道病毒被分离鉴定，其中3株（BHM26、BJ50和BJ001株）为EV-F2，2株（HY12与HLJ-3531/2013株）为EV-E，这些病毒均从表现腹泻的牛粪便中分离获得。
本研究中病牛表现精神沉郁、呼吸困难、咳嗽、流涕等症状，发病牛数量多、发病率高，从症状和流行特点难于判断是由何种病原引起。国内牛呼吸道病流行病学调查显示，牛传染性鼻气管炎、牛副流感病毒3型和牛呼吸道合胞体病毒为牛主要呼吸道病毒性病原，因此对采集的30份牛鼻拭子进行了这3种病原的核酸检测，结果均为阴性。由于国内还未见从患呼吸道疾病的病牛鼻拭子中分离肠道病毒的报道，所以当时并未考虑牛肠道病毒的感染。为了查明本次疾病流行的原因，对30份牛鼻拭子用MDBK细胞进行病毒分离，结果分离出1株有CPE的病毒，命名为NM575。通过CPE、电镜观察和理化特性的鉴定，发现所分离的病毒符合小RNA病毒特点，因此设计牛鼻病毒和牛肠道病毒特异性引物进行核酸鉴定，结果用牛鼻病毒引物未扩增出条带，而用牛肠道病毒引物扩增出特异的阳性条带。对阳性条带进行克隆测序，进一步序列分析表明分离病毒NM575与牛肠道病毒BEV-261株核苷酸同源率高达80%。经MEGA软件分析，NM575与德国牛肠道病毒分离株BEV-261株处于同一分支，从而证实NM575为牛肠道病毒，为国内首次从患呼吸道病牛的鼻拭子中分离到牛肠道病毒的报道。有报道表明牛肠道病毒感染可引起牛呼吸道疾病的暴发，所以本次牛呼吸道疾病的暴发可能是牛肠道病毒感染所致。
病毒体外细胞培养结果显示，NM575可感染牛、仓鼠、猪、犬和鸡等多种动物细胞，尤其在牛源细胞中复制滴度最高，与相关文献报道中牛肠道病毒体外培养细胞嗜性相符。张海丽等研究结果表明牛肠道病毒分离株HLJ-3531/2013株能够感染Vero细胞，而NM575在Vero-E6中不增殖。这可能是由毒株血清型的差异造成的，其中HLJ-3531/2013株为EV-E型，而本研究分离毒株为EV-F型。
2013年3月，经国际病毒分类委员会批准，重新将肠道病毒属进行归类，共分为12个病毒种，牛肠道病毒被重新分为肠道病毒E（EV-E）和肠道病毒F（EV-F），其中EV-E又包括4种基因型（E1、E2、E3和E4），EV-F又分为6种基因型（F1、F2、F3、F4、F5和F6）。肠道病毒P1区主要负责编码结构蛋白，该区域种内发生重组的概率很小，因此常作为肠道病毒分型的依据。本研究选取P1基因进行了序列测定和比对以及系统进化分析，结果显示分离毒株NM575与德国分离株BEV-261核苷酸同源率最高，处于同一分支，同为EV-F，基因型为EV-F1。
结合病牛临床症状、流行特点、病毒所致的细胞病变特征、病毒形态学特征、体外细胞培养嗜性和特异性RT-PCR鉴定结果，证明所分离毒株NM575为牛肠道病毒，基因分型为EV-F1。本研究结果提示我国患呼吸道疾病牛的上呼吸道中存在牛肠道病毒，为今后该病的诊断、流行病学调查以及牛肠道病毒免疫学、致病机理和免疫预防的进一步研究奠定了基础。
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