2结果与讨论
2.1非脱羧勒克菌wt16对不同地区黄曲霉菌生长的影响
由图1可知，在沙氏液体培养基中，与对照组相比，非脱羧勒克菌wt16菌株能使不同地区黄曲霉菌丝干重明显降低，其抑制率最低为77%，最高为92%，而与对照菌株大肠杆菌共培养的不同地区黄曲霉菌菌丝干重并未明显降低，表明wt16能有效抑制不同地区黄曲霉菌的生长。
图1 wt16对不同地区黄曲霉菌生长的影响
2.2非脱羧勒克菌wt16对不同地区黄曲霉菌产毒的影响
由图2可知，在沙氏液体培养基中，与对照组相比，非脱羧勒克菌wt16菌株能使不同地区黄曲霉菌合成的毒素明显降低，其抑毒率最低为90%，最高为96%，而与大肠杆菌共培养的不同地区黄曲霉菌产毒并未明显降低，表明wt16能有效抑制不同地区黄曲霉菌的产毒。
图2 wt16对不同地区黄曲霉菌产毒的影响
2.3非脱羧勒克菌wt16在花生粉上对不同地区黄曲霉73菌生长与产毒的影响
为了探究非脱羧勒克菌wt16菌株是否也能应用于营养条件复杂的花生中，本实验在花生粉上同时接种黄曲霉73菌及非脱羧勒克菌wt16。由图3可知，在花生粉上，经由黄曲霉73菌侵染的花生粉上长满了黄绿色黄黄曲霉孢子，而非脱羧勒克菌wt16与黄曲霉73菌共培养的花生粉上黄曲霉孢子明显减少，说明wt16菌株能明显抑制黄曲霉生长;由图4可知，与对照相比，经黄曲霉菌侵染的花生粉经非脱羧勒克菌wt16处理后，处理组中黄曲霉73毒素B1含量明显低于对照组，其抑制率达83.19%。
图3 wt16在花生粉上对黄曲霉生长的影响注:(A)为经由黄曲霉菌73侵染的花生粉;(B)为黄曲霉菌73与wt16共培养的花生粉。
图4 wt16在花生粉上对黄曲霉菌73产毒的影响
2.4非脱羧勒克菌wt16在花生颗粒上对黄曲霉73菌生长与产毒的影响
为了探究研究非脱羧勒克菌wt16菌株在无机械损伤的花生粒上是否也有抑制黄曲霉73生长及产毒的作用，本实验在花生粒上同时接种黄曲霉及非脱羧勒克菌wt16。由图5可知，在花生上，经由黄曲霉73菌侵染的花生粒表面长出许多黄绿色的孢子，而黄曲霉73与非脱羧勒克菌wt16共培养的花生粒上黄曲霉孢子明显减少，说明wt16菌株能显著抑制黄曲霉生长;由图6可知，与对照相比，经黄曲霉73菌侵染的花生粒经wt16处理后，处理组中黄曲霉73毒素B1含量明显比对照组低，其抑制率达88.64%。
图5 wt16在花生粒上对黄曲霉菌73生长的影响注:图A为黄曲霉菌T3与wt16共培养的花生粒;图B为经由黄曲霉菌73侵染的花生粒。
图6 wt16在花生颗粒上对黄曲霉73菌产毒的影响
2.5非脱羧勒克菌wt16菌株对黄曲霉73菌株形态影响扫描电镜分析
黄曲霉菌73在沙氏液体培养基中培养5 d后可观察到，黄曲霉73可形成规则的菌丝球体，单个菌丝呈细长型，表面有绒毛(图7A)，而与非脱羧勒克菌wt16作用后，黄曲霉73菌丝会聚集成不规则形状，单个菌丝会由细长型断裂成小截形态，菌丝表面会变得较光滑(图7B)。
图7 wt16菌株对黄曲霉菌株形态影响扫描电镜图
注:(A)为黄曲霉73菌丝体在扫描电镜下放大100×、2000×、5000×、20000×的形态图;(B)为与wt16菌株作用过后的黄曲霉73菌丝体在扫描电镜下放大100×、2000×、5000×、20000×的形态图。
2.6非脱羧勒克菌wt16菌株不同发酵组分对黄曲霉73菌的影响
由表1可知，与对照Ⅰ相比，非脱羧勒克菌wt16上清液能抑制黄曲霉73菌的生长及产毒，进行高温处理后的上清液只能抑制黄曲霉73菌的产毒而不能抑制黄曲霉73菌的生长，非脱羧勒克菌wt16的死菌体对黄曲霉73菌没有作用，而大肠杆菌的上清液(对照Ⅱ)不能抑制黄曲霉73菌产毒，说明非脱羧勒克菌wt16上清中有某种代谢产物对黄曲霉菌株73菌的产毒和生长有抑制作用，并且其代谢产物中有某些可以抑制黄曲霉73菌生长的产物在经高温处理后会失去抑制作用，而高温对能抑制产毒的代谢物质无影响。
表1 wt16不同组分对黄曲霉73菌的影响(n=3)
2.7发酵时间对非脱羧勒克菌wt16菌株有效成分的影响
由图8可知，对照组中黄曲霉毒素含量为(237.27±13.63)ng/mL，黄曲霉73菌在培养1 d的非脱羧勒克菌wt16上清液中生长5 d后产毒量为(30.83±3.59)ng/mL，其抑制率为87%，1～3 d对黄曲霉菌73的产毒抑制率差异性不显著(p>0.05)，6 d培养出来的wt16上清液对黄曲霉菌73的产毒抑制率最高，其毒素含量为(11.5±3.08)ng/mL，抑制率达93.85%，但4～9 d的抑制率差异性不显著(p>0.05)，因此wt16培养时间超过4 d最佳。
2.8发酵温度对非脱羧勒克菌wt16有效成分的影响
由图9可知，在10℃时wt16菌株会变性，菌液变粘稠，无法离心制备wt16菌株的发酵上清液，在45℃时wt16菌株不生长。实验结果发现，对照组毒素含量为(294.71±6.65)ng/mL，在40℃培养时wt16发酵上清液对黄曲霉73菌的产毒抑制率最高，其毒素含量为(11.61±4.04)ng/mL，对黄曲霉73菌的产毒抑制率达96.1%，其余温度毒素含量差异性不显著(p>0.05)，因此wt16培养温度在15～40℃均可。
图9发酵温度对wt16有效成分的影响
3结论
本实验在前期筛选获得一株非脱羧勒克菌wt16的基础上，首次研究表征了非脱羧勒克菌wt16对黄曲霉具有抑生长性及抑毒性，研究发现在液体培养基中，非脱羧勒克菌wt16能明显抑制黄曲霉菌的生长及产毒，并且对不同地区分离出来的黄曲霉菌均有抑制作用，其对黄曲霉菌丝生长抑制率达77%、92%，对黄曲霉菌产毒的抑制率达90%～96%，对有无损伤的花生均能抑制黄曲霉菌的生长及产毒。用扫描电子显微镜观察发现非脱羧勒克菌wt16能改变黄曲霉菌菌丝形态。非脱羧勒克菌wt16在15～40℃条件下培养4 d后，其发酵上清液对黄曲霉菌产毒抑制率最高。
虽然黄曲霉毒素的生物防治取得了一定的研究进展，但目前的研究仍存在许多不足之处，对其有效抑菌成分的研究还缺乏深入的探讨，如果能分离鉴定出确切的抑菌成分，将会加速生防黄曲霉毒素研究的进程，初步认为该非脱羧勒克菌wt16菌株能通过产生次级代谢产物来抑制黄曲霉的生长及产毒，这个结果与其他拮抗剂如枯草芽孢杆菌及短小芽孢杆菌的研究结果一致。本研究发现非脱羧勒克菌wt16对黄曲霉的生长及产毒有很好的抑制作用，具有潜在的应用价值，但由于本实验未做安全性评价，为了避免活菌影响，本实验室将进一步研究非脱羧勒克菌wt16上清液内的有效活性成分，再利用对环境无害的活性成分进行黄曲霉菌生物防治的应用。
实验证明：非脱羧勒克菌wt16可抑制黄曲霉生长性及产毒（一）
实验证明：非脱羧勒克菌wt16可抑制黄曲霉生长性及产毒（二）