研究简介
生物防治剂(BCA)的开发得到了显着推动，因为许多作物保护化学组已从欧盟批准的用于农业/园艺作物的化合物清单中删除。由于BCA是活生物体，它们的使用和功效在很大程度上取决于环境条件，而对于化学产品，这种影响不太显著。虽然以前的研究主要集中在这种酵母生物防治剂的液体制剂上，但关于干燥制剂及其在不同相互作用环境条件下的弹性的信息很少。最近Carb等人研究了用于提高收获前应用的生物防治剂干制剂的生存和环境压力耐受性的潜力。这些是基于流化床喷雾干燥的配方，包括可生物降解的涂层。这种方法还可以提供对不同作物上的真菌病原体具有更广泛活性的制剂。因此人们有兴趣开发一种环境筛选系统，以促进BCA配方的比较和识别，这可能具有所需的生态恢复力，特别是对于收获前的应用。其中一种方法是使用Bioscreen C全自动生长曲线分析系统，该系统允许在不同相互作用的非生物和营养因素下自动比浊测量活力和恢复力。本论文的研究的目标是（a）优化Bioscreen C全自动生长曲线分析系统以清酒假丝酵母菌CPA-1的生长，（b）比较温度（15-30°C）相互作用的环境因素的影响)、pH(3–7)和水分活度(aw;0.94–0.99)对液体的商业配方和BCA清酒假丝酵母菌CPA-1的两种干燥配方的活力和生长的影响，使用优化的比浊法和(c)确定清酒CPA-1配方在相互作用的环境条件下生长的检测时间，以比较它们的弹性。
Bioscreen全自动生长曲线分析仪的应用
Bioscreen C全自动生长曲线分析仪用于分析浊度。对于所有测定，在非标准100孔微量滴定板的每个孔中加载200µl接种培养基。在每个实验所需的时间内，使用600 nm滤光片定期记录光密度(OD)。使用制造商提供的软件Easy Bioscreen Experiment记录所有获得的数据。然后，将数据导出到Microsoft®Excel®Professional 2013工作表以供进一步分析。
实验结果
使用Bioscreen C全自动生长曲线分析仪优化的环境筛选能够快速比较不同配方在目标生态位中的适应能力。对于本研究中评估的三种配方，证明清酒假丝酵母菌CPA-1（BCA）在广泛的环境条件下有效，在极端环境压力条件下有一些限制。尽管流化床喷雾干燥制剂会导致一些细胞损伤，但它们似乎在干燥后显示出有效的环境适应能力。马铃薯淀粉配方能够扩展生态位范围，尤其是对高温的耐受性，这可能是由于在干燥过程中加入了可生物降解的涂层。
图1、在优化合成葡萄汁期间获得的生长曲线，使用BioscreenC全自动生长曲线分析仪测定清酒假丝酵母菌CPA-1在培养基中的生长曲线：a)用半固体培养基在不摇动的情况下获得的平均生长曲线（十个单独的重复）；b)自动读数前20秒摇动液体培养基获得的平均生长曲线（10次重复）；c)用连续摇动的液体培养基获得的平均生长曲线（十个单独的重复）；d使用液体介质连续摇动获得的各个曲线，不同的虚线表示每种配方的不同浓度。
图2、在优化Bioscreen C全自动生长曲线分析仪测定中使用的接种物大小期间获得的初始浊度值。代表了三种配方：Candifruit（■）、马铃薯淀粉配方（实心三角形▲）和麦芽糖糊精配方(●)。每个配方的线性回归用虚线表示。使用具有连续振荡处理的液体SGJ介质。数值是接种后前10分钟内每2分钟记录的五个读数的平均值，每种制剂使用三个孔。
图3、OD600和清酒假丝酵母菌（CFU ml-1）在不同生长时间与初始接种量为105 CFU ml-1之间的相关性。代表了三种配方：Candifruit（■）、马铃薯淀粉配方（实心三角形▲）和麦芽糖糊精配方(●)。功率趋势线用虚线表示。使用连续摇动的液体SGJ培养基。
图4、每种测试配方的总结效果：Candifruit、马铃薯淀粉和麦芽糖糊精。三种研究配方表示为LogWorth百分比值，以比较模型中的效果：温度（填充浅灰色方块）、水分活度（填充灰色方块）和pH值（填充黑色方块）。
图5、在每种评估条件（温度、水分活度和pH值）下，清酒假丝酵母菌CPA-1实现生长的接种孔百分比的图形表示。每张图中表示三种配方：Candifruit（■）、马铃薯淀粉配方（实心三角形▲）和麦芽糖糊精配方(●)。对于每种处理和来源，由相同字母链接的百分比值没有显著差异（P<0.05)根据正交对比分析。不同的大写字母表示相同条件（温度、水分活度或pH）下清酒假丝酵母菌CPA-1制剂之间的显著差异。不同的小写字母表示同一配方内不同评估温度、水分活度或pH条件之间的显著差异。
总结
生物防治微生物的环境适应能力一直是开发有效制剂的主要瓶颈。清酒假丝酵母是一种有效的生物防治剂(BCA)，可对抗扩张青霉、灰霉病菌或根霉，最近优化了生物防治剂的不同配方。本研究使用Bioscreen C全自动生长曲线分析仪比较生物防治剂清酒假丝酵母的不同干燥和液体制剂对相互作用的环境条件的相对耐受性。采用这种自动化的浊度法对生物控制酵母的不同配方进行了优化。清酒假丝酵母菌CPA-1菌株在合成葡萄汁培养基中在连续摇动下生长，初始浓度为105 CFUs ml-1，获得了最好的生长曲线。所有配方都显示出光密度值和酵母浓度之间的直接关系。当温度(15–30°C)和水分活度(aw;0.94–0.99)对酵母弹性的影响最大，而pH值(3–7)的影响最小。一般而言，液体配方在更多相互作用的环境条件下生长更快，但只有干马铃薯淀粉配方中的酵母细胞可以在某些压力条件下生长。这种快速筛选方法可用于有效识别不同生物防治制剂在相互作用的生态非生物条件下的适应能力。
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