3讨论
E蛋白大小约为50 kD，主要由β链组成，在晶格中组装成反向平行的二聚体。成熟的病毒体上排列有90个E蛋白二聚体。E蛋白具有3个不同的结构域，中央结构域Ⅰ由九链混合的β-桶组成，结构域Ⅱ主要由β链组成，而结构域Ⅲ形成免疫球蛋白样折叠结构(Liu et al.,2015)。E蛋白是JEV的主要结构蛋白，同时E蛋白上有多个抗原表位，能够参与病毒感染后诱发的免疫反应。本研究测序发现，JEV rSA14和rJEV-EI176R的E蛋白确实存在176位点I-R的突变，分别对JEV rSA14和rJEVEI176R的氨基酸基本序列特征分析发现，该蛋白有500个氨基酸，同时发现I-R突变是脂肪族中性氨基酸到碱性氨基酸的突变。Zheng等(2018)研究发现，当E蛋白中某些氨基酸突变为碱性氨基酸时，会导致毒株的毒力降低。
本研究发现，E176位点I-R的突变导致E蛋白等电点上升，推测是因为病毒在体外传代的过程中会发生正电荷突变，从而使病毒更能适应体外培养。E蛋白的Pymol分析显示，I-R的突变导致了176位点氢键结合的变化，蛋白质内部氢键的变化可能会导致蛋白质自身结构以及功能的变化。研究表明，JEV关键毒力位点上E138氨基酸的变化会导致与E47氨基酸的氢键连接变化，而突变E47位氨基酸同样也会引起毒力的改变。本研究发现，位点突变后的病毒E蛋白二级结构中的α-螺旋、β-折叠、延伸链以及无规则卷曲的数量及占比均发生了改变，这些改变可改变E蛋白的空间结构，同时，蛋白质的功能作用取决于其空间结构，揭示位点突变后E蛋白的结构变化有助于阐释病毒的减毒机制。
以上都是基于预测进行的结构分析，对于E蛋白176位点I-R的突变会导致病毒毒力减弱的机制提供部分理论基础。E176的单一I-R突变减弱了JEV的神经毒力，该突变病毒株rJEV-EI176R与亲本病毒株rSA14在BV-2细胞中具有相似的生长特性，在BV-2细胞、U-251细胞、Vero细胞和BHK-21细胞上均观察到绿色荧光，显示了突变病毒对于不同细胞的适应性。在BV-2细胞中，rJEV-EI176R病毒对细胞的附着度增加，这意味着细胞在生物活动中有更多的机制来改变病毒的数量。探究病毒突变前后的生长特性有助于揭示病毒在机体中复杂的减毒机制。
在细胞因子的释放过程中，小胶质细胞起到重要作用，小胶质细胞表达不同的模式识别受体以确认病毒，病毒入侵中枢神经系统之后会引起细胞因子和促炎症因子的释放(Nayak et al.,2014)。本研究发现，亲本株rSA14病毒相较于突变株rJEVEI176R病毒能够引起BV-2细胞释放更多的TNF-α、IL-6和IP-10，导致更严重的炎症反应。TNF-α能作为促炎症因子诱导小胶质细胞产生大量细胞因子及趋化因子，作用于神经元引起损伤；此外活化的小胶质细胞还能通过释放谷氨酸盐引起神经毒性，而谷氨酸盐的合成增多又与其释放的TNF-α密切相关。
高水平的TNF-α能够引起白细胞黏附内皮细胞进入炎性反应区，释放降解酶和活性氧，清除病毒并造成组织损伤，且其分泌与病情严重程度相关(Jang et al.,2021)。高水平的IL-6可以促进转化生长因子的产生，导致血脑屏障通透性增加，加重脑水肿(Tanaka et al.,2014)。在中枢神经系统发生感染时，小胶质细胞开始活化并大量表达IP-10，介导炎性细胞浸润，启动或促进炎性反应进程(Qiao et al.,2022)。研究表明，JEV P3株病毒感染BV-2细胞能够促进TNF-α、IL-6、CCL-2炎性因子的表达和分泌，这些细胞因子的大量释放使神经元发生间接损伤，如TNF-α、IL-1β、IL-6、MCP-1、IP-10等，能引起脑部各区细胞不同程度的形态变化(蒋蓉等,2013)。小胶质细胞活化早期对于机体有效地抵抗病毒入侵是有利的，但是随着小胶质细胞的过度活化，产生的过多炎性因子会导致炎症发生，从而造成不可逆的炎症损伤。
4结论
本研究通过序列分析和生物信息学方法测定了重组点突变rSA14和rJEV-EI176R病毒的E蛋白基因序列、二级结构和176位点在突变前后的氢键连接变化，通过对E蛋白结构的预测分析，可以对E蛋白176位点I-R的突变所导致的病毒毒力减弱的机制提供部分理论基础。同时，测定了重组点突变病毒rJEV-EI176R和亲本株病毒rSA14的生长特性和诱导细胞因子表达分泌的差异。本研究对比揭示了JEV SA14病毒E蛋白176位点I-R突变后的生物学特性变化，为深入探究E蛋白功能特征和深入阐释该位点突变后的减毒机制及疫苗研发提供了理论基础。
乙脑病毒株囊膜蛋白I176R位点在BV-2细胞上的生长特性差异——摘要、前言
乙脑病毒株囊膜蛋白I176R位点在BV-2细胞上的生长特性差异——材料与方法
乙脑病毒株囊膜蛋白I176R位点在BV-2细胞上的生长特性差异——结果与分析
乙脑病毒株囊膜蛋白I176R位点在BV-2细胞上的生长特性差异——讨论、结论