抗菌药物PK/PD研究在新抗菌药物的开发、临床合理使用方面具有广泛的应用价值，但这些PK/PD理论多数是基于最低抑菌浓度(minimal inhibitory concentration,MIC)的数据做出的，如与疗效最相关的PK/PD指数、靶值、达标概率、折点等，均与MIC值有关。
MIC值是在系列固定浓度的固体或液体培养基上培养一段时间后获得的结果，是药物的平均作用结果，不能反映药物作用的时间过程。另外，MIC值的精度有限，这影响了基于MIC值的精确分析。
近年来，定量药理学技术得到迅猛发展，其理论可以更好地指导抗菌药物的研究。
本文是利用建模理论，用数学模型拟合西他沙星、莫西沙星、左氧氟沙星对金葡菌的体外杀菌曲线，求得关键的药效动力学参数，以及与喹诺酮类药物临床效果最相关的PK/PD指数、PK/PD靶值，以反映药物作用的情况，所获得的结果与已有的数据进行比较，探索体外PK/PD研究的价值。
1、材料和方法
1.1抗菌药物和培养基
西他沙星：批号：080813，效价：92.9%，提供单位：天津汉康医药生物技术有限公司；莫西沙星：批号：091202，效价：95.7%，提供单位：杭州样样康生物技术有限公司；左氧氟沙星：批号：K-Y-L-H-M20090701，效价：86.4%，提供单位：浙江普洛康裕制药有限公司。MH培养基，培养条件为35℃，孵育16~20h。
1.2实验菌株
金黄色葡萄球菌：07H071，为来自本单位临床的分离菌。
1.3 MIC测定
采用标准平皿二倍稀释法。抗菌药物测定浓度范围256~0.008mg/L。供试菌悬液用多点接种仪接种，每点接种量为104CFU。测定各抗菌药物对各种致病菌的最低抑菌浓度。
1.4静态杀菌曲线
在营养肉汤中加入一定浓度的待测抗菌药物及菌应用液，使培养液中细菌的终浓度在(1~5)×105CFU/mL左右(对照管中不含抗生素)。取即刻1、2、4、6、8、12及24h的培养物，进行菌落计数，并绘制杀菌曲线。
1.5数学建模
细菌接种到生物体系中，在无药物存在的情况下，细菌早期会按照指数的形式生长。随着营养的消耗和菌体的增加，不再按照指数形式增长，逐渐进入静止状态。在此状态下，体系会维持菌量在一定的水平。随着时间的继续延长，菌体的死亡速度超过生长速度，菌量会逐渐下降。
在实际试验中，因观察时间有限，如常常观察到24h，此时菌体达到平衡或从平衡处开始下降(死亡的速度大于生长的速度)。对菌体生长的描述，目前比较成功的方法是采用2室模型的方法进行描述，其流程图见图1。
其假设接种的菌体分为敏感菌(S)和不敏感菌(P)，只有S菌具有生长的能力，生长系数为Ks，且S菌可以转化成P菌，转化速率常数为Ksp，同样P菌也可以转化成S菌，转化系数为Kps，但一般认为Kps为0。
另外S、P菌均按照同样的速率死亡，其系数为Kd。药物的作用被认为是只作用在S菌。基于以上模型，可以构建如下的方程：
一定数量的细菌接种到体系中，细菌不是马上进入到对数生长阶段，而是存在一个滞后现象。
在上述方程中，接种到体系的细菌，按照比例系数F值分成两种状态。对于体系中的药物浓度C，假定实验期间保持恒定，这对目前实验的3种比较稳定的抗菌药物基本是符合的。
1.6数据分析
在无药物存在的情况下，对空白对照组的细菌生长曲线进行拟合，按照目标函数最小的优化方式，求得最佳的F、Nmax、Kd，并将此参数在随后的拟合中，保持不变。将不同MIC值条件下的菌量变化和空白对照组再一同进行拟合，求得各个参数。
所建立的方程(1)~(4)中，有代数方程和微分方程，无法通过常见的解微分方程组的方式进行求解，本文采用了有解微分和代数方程能力的Matlab软件(Release 2012a,MathWorks,Natick,MA,USA)进行了数据计算，通过nlmefit()指令进行非线性混合效应的拟合。经过多次迭代，求得方程中各种参数的最佳值。
根据所建立的模型，模拟不同药物浓度情况下24h时体系中细菌的存量。将药物浓度乘以时间除以MIC值，就可获得AUC/MIC值，以该值和体系中细菌的量作图，就可以观察细菌计数随着时间的变化规律，推测PK/PD的靶值。
1.7模型验证
采用常用的方法，如目标函数值、测定值和拟合值的一致性情况进行模型的验证。
2、研究结果
2.1静态杀菌曲线
实验中，根据菌株的MIC值，除了空白对照组外(Scinario 5)，还进行了MIC为1、2、4、8h的药物浓度杀菌曲线研究分别对应Scinario 1~Scinario 4，对这些杀菌曲线的情况见图2。
2.2模型参数和PK/PD靶值
目前所建立的模型可以模拟静态情况下的杀菌曲线，拟合图见图2。在该图中，所建立的模型，可以较好地拟合3种药物不同浓度下的杀菌曲线。基于模拟曲线获得的关键参数见表1。
表1中，反映药物作用的EC50参数在3种药物之间是有区别的，该值越小，杀菌活性越强。模拟的AUC/MIC与24h细菌计数的结果见图3。
图3模拟的24h后体系中细菌菌落数与3种不同喹诺酮类药物PK/PD指数-AUC/MIC的关系
从该图中可以看出，细菌计数值(药效学)与AUC/MIC是直接相关的，即说明了这3个喹诺酮类药物的PK/PD指数是AUC/MIC；另外，依据细菌的计数不再下降的情况，很容易地计算出其PK/PD靶值，其值对3种药物而言，均在50左右。
3、讨论
以往主要用感染动物的PK/PD研究，来确定抗菌药物PK/PD指数、PK/PD靶值，这些研究方法复杂、周期长，推广困难。本文采用非线性混合效应模型的原理，进行了静态体外杀菌曲线的拟合。
从获得的结果看，所建立的模型能够反映细菌的生长情况，由此获得的关键的药效学指标，如Emax、EC50，可以用来进行抗菌药物作用效果的初步评价。
从本实验中，也可以进行PK/PD指数、PK/PD靶值乃至给药剂量的预测。在本文的结果中，3个不同药物之间的Emax值基本相同，但EC50相差较大。
以EC50反映的活性中，西他沙星是莫西沙星的5倍，是左氧氟沙星的6.5倍，临床剂量与体外活性的差别相一致。
在目前确定的临床常用药物剂量中，西他沙星为50mg，莫西沙星为400mg，左氧氟沙星为500mg。从模拟的AUC/MIC结果与细菌菌量的关系中可以看出，达到细菌计数不再下降的AUC/MIC值在50左右，且3种药物之间差别很小。该结果与文献报道的喹诺酮类药物在抗革兰阳性菌的研究中所获得的靶值也是一致的。
以上结果说明，利用体外杀菌曲线结合建模和仿真技术，具有重要应用价值，可以对抗菌药物的PK/PD指数和靶值进行预测。进一步的研究，可以在该结果的基础上展开；也可以对新的抗菌药物进行PK/PD初筛，增加临床试验的成功率。
本实验模型中，药物浓度是按照恒定值进行计算，这与这3种药物在溶液状态下比较稳定的情况是一致的。进一步的模型优化中，可以将药物的降解因素考虑进去。也可以模拟药物浓度在体内的变化，结合细菌的变化，建立动态体外PK/PD模型，从而获得与临床用药更加一致的研究环境，其研究结果将更具指导意义。另外，也可以在一个浓度下，多次测试杀菌曲线，建立群体模型，加入实验变异的影响。
本实验作为一项探索性体外PK/PD研究，探讨了杀菌曲线建模的可行性，以及其结果的预测能力。研究中，仅局限在一种临床分离菌和3个同类作用机制药物的比较研究。针对新的抗菌药物，需要开展涵盖更多临床致病菌、多种给药方式的全面研究。
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