氨基甲酸乙酯，也称为EC和氨基甲酸乙酯，是食品和饮料加工和发酵过程中产生的有害物质。它被认为是加工污染物，因为它被归类为2A致癌物，并且可能对人类致癌。食品饮料发酵过程中EC的形成途径主要包括两条途径：微生物代谢精氨酸生成EC和乙醇与氰苷反应生成EC。因此，目前降低EC浓度的策略包括抑制EC形成的前体（精氨酸和氰苷）和直接降解EC。球形赖氨酸芽孢杆菌MT33可以降解葡萄酒中高达60%的EC。因此，筛选能够降解EC的菌株是降低EC浓度的一种有前景的方法。
在美国食品和药物管理局的一份关于酒精饮料的报告中，大多数样品中的EC浓度低于100µg/L，而雪利酒中的EC浓度超过500µg/L。此外，蒸馏酒通常比葡萄酒和啤酒含有更多的EC。许多国家制定了限制酒精饮料中EC的法规和建议；例如在加拿大，清酒中允许的EC浓度低于200微克/升，而蒸馏酒中允许的EC浓度低于150微克/升；在美国蒸馏酒中EC浓度的允许限值小于125µg/L；在欧洲，捷克共和国和法国的蒸馏酒中的EC限值低于150µg/L。中国白酒是世界上最古老、最受欢迎的蒸馏酒之一，其EC含量很高，必须加以控制。
目前大多数研究都集中在EC缓解策略上。在本研究中，我们的目的是筛选能够直接降解EC的菌株。在这里，研究人员报道了两种乙醇假丝酵母菌株（J1和J116），从发酵谷物中分离出来，可以直接降低EC浓度。这两种酵母使用EC作为唯一碳源生长，并且它们在不同的碳源上生长良好。值得注意的是，经过壳聚糖固定化后，两株菌株在24 h内对白酒中EC的降解率分别为42.27%和27.91%，优于现有的性能。非固定化菌株。此外，通过气相色谱-质谱联用技术研究，挥发性有机化合物含量并不影响中国白酒的主要风味物质。因此，酵母J1和J116有可能用于中国白酒的处理和商业化。
Bioscreen全自动微生物生长曲线分析仪的应用
将所制备的补充有0g/L、5g/L和10g/L EC的YNB培养基的孔用108 CFU/mL的分离菌株接种并在28℃下孵育。使用Bioscreen C全自动生长曲线分析仪在600 nm(OD 600)处测量分离菌株的生长。每个含有300μL培养基（YNB，0 g/L、5 g/L和10 g/L EC）的微孔板接种10μL接种物。将微孔板在28℃下孵育48小时，并且每小时监测每个微孔板孔的OD 600。每次测量前将微孔板摇动10秒。在每个测定中对每个条件进行三个重复孔。
实验结果
本研究的目是筛选能够直接降解EC的菌株。结果从发酵谷物中分离出两种乙醇假丝酵母菌株，命名为J1和J116。这两个菌株能够以10 g/L EC作为唯一碳源生长（OD 600高达0.73和0.68）并且很好地同化了不同的碳源。此外，固定化菌株J1可将白酒中的EC浓度从253.03±9.89μg/L降低至146.06±1.67μg/L（降低42.27％），而固定化菌株J116将其降低至182.42±5.05μg/L（降低27.91％）。24小时内。这些结果优于非固定化J1和J116获得的结果。此外，固定化J1和J116处理后VOC含量略有变化。然而导致EC含量降低的许多其他因素仍有待研究，例如J1和J116降低中国白酒中EC浓度的具体机制以及VOC含量变化的原因。
图1、以EC为碳源生长的菌株的系统发育树。在这些菌株中，J6、J9、J21、J22和J78被鉴定为毕赤酵母(Pichia manshurica)、毕赤酵母(Pichia galeiformis)和毕赤酵母(Pichia sp)。菌株J34和J40分别与近平滑念珠菌分离株Y1和近平滑念珠菌培养物CBS:2215表现出最高的同源性。菌株J128与拜氏接合酵母(Zygosaccharomyces bailii)分离株ML3表现出最高的同源性。其余分离株与乙醇假丝酵母分离株ZJ-21、乙醇假丝酵母分离株A37.4、乙醇假丝酵母菌表现出最大的同源性分离株41和乙醇假丝酵母分离株3-1-19。蓝色箭头显示选择用于进一步研究的菌株（J1、J10、J14、J34、J53、J78、J116、J128）。
图2、J1、J10、J14、J34、J53、J78、J116和J128的碳源同化。通过选择菌株J1、J10、J14、J34、J116和J128进行生长曲线分析。研究表明从玉米芯中提取的酵母优先使用葡萄糖，其次是木糖和阿拉伯糖，同时可以高选择性地高效利用甘油生产阿拉伯糖醇，并且体积生产率从0.13 g/Lh提高到0.33 g/Lh。
图3、J1、J10、J14、J34、J116和J128分离菌株的生长曲线。测量生长曲线48小时。这些培养基的浓度制备为0、5和10g/L。灰线表示0 g/L，黄线表示5 g/L，蓝线表示10 g/L。根据OD 600值，J1和J116在不同浓度EC存在下表现出较强的活力，而J10、J14、J34和J128生长较差。对于J10，对照组的OD 600(0.64)优于使用EC(5 g/L和10 g/L)作为碳源时的OD 600(分别为0.38和0.34)。对于J14和J34菌株，OD 600没有碳源和EC作为碳源处理48小时后，没有显着变化（分别约为0.32和0.38）。J128生长得不好。对数生长期和滞后期不明显，OD 600值不高（仅0.43）。酵母J128在5 g/L EC培养基中比在10 g/L EC培养基中生长得更好。
图4、固定化J1、J1和固定化J116、J116处理24 h后白酒的EC浓度。这些系统中EC浓度在24小时内显著下降。与非固定化菌株不同，壳聚糖固定化J1和J116的EC降解能力显着提高。J1的降解率为非固定化菌株的2倍，固定化J116的降解率为非固定化菌株的1.47倍。
图5、固定化J1、固定化J116在室温下处理24小时后中国白酒中挥发性有机化合物的热图。18种酯和5种有机酸的热图在右侧以不同的颜色显示。红色代表对照组。绿色代表固定的J1基团。蓝色代表固定的J116基团。
总结
氨基甲酸乙酯(EC)是食品和饮料发酵过程中产生的2A类致癌物，主要存在于蒸馏酒中。目前，大多数研究都集中在EC缓解策略上。本研究中研究人员的目标是降低发酵蒸馏酒中的EC含量。为此研究人员从发酵谷物中筛选出能够利用EC作为碳源生长的菌株，并验证了它们直接降解中国白酒中EC的能力。同时，由于白酒中的高浓度乙醇和酸性环境限制了菌株降解EC的能力，我们采用壳聚糖固定化菌株，并比较固定化对白酒中EC含量的影响。此外还检测了固定化菌株处理前后中国白酒VOC含量的变化。本研究筛选的菌株将有利于进一步研究其作用机制和中国白酒的商业化。