长期以来，我国农业采用粗放生产模式和高投入的水肥管理，造成土壤养分比例失调和生物多样性单一，连作障碍问题日益突出，对我国设施蔬菜可持续发展造成严重威胁。其中由植物病原真菌引起的土传病害是限制生产的主要因素，严重影响蔬菜产量和品质，给农业生产带来了巨大的经济损失。
茄病镰刀菌（Fusarium solani）作为引发黄瓜根腐病的病原菌之一，主要侵染植株根部，导致根部出现水渍状腐烂，失去吸收水分及养分的能力，最终导致植株死亡，造成黄瓜产业经济损失严重。研究表明，西藏设施西（黄）瓜根腐病原菌为茄病镰刀菌；而刘洋研究也表明，茄病镰刀菌瓜类专化型（Fusarium solani f.sp.cucurbitae）会引起嫁接的黄瓜根茎腐病。因此，解决由茄病镰刀菌引起的根腐病对黄瓜生产和农业可持续发展至关重要。
目前，化学防治可有效防治土传病害，但其价格高，高毒残留严重影响人类健康和自然环境，并且病害和农药用量不断增加的恶性循环严重破坏生态平衡。使用植物根际促生菌（plant growth promoting rhizobacteria,PGPR）和生物防治剂（biocontrol agents,BCAs）是防控根腐病的一种替代方法，利用有益微生物或微生物分泌的代谢产物，通过直接或间接机制抑制病原体生长，有利于促进作物健康生长。芽孢杆菌属的菌株因其营养需求简单、繁殖生长快、代谢产物丰富、可产抗逆性芽孢等特点而具有显著的生防潜力，成为研发生防菌剂的理想菌株。Kim等分离得到一株产多肽的解淀粉芽孢杆菌（Bacillus amyloliquefaciens）PT14-4a，对茄病镰刀菌具有显著的抑制作用；枯草芽孢杆菌（B.subtilis）SPB1对茄病镰刀菌有较强抑菌活性；杨晓燕等发现枯草芽孢杆菌对多种致病菌有良好的拮抗效果，其中包括茄病镰刀菌。此外，芽孢杆菌还表现出促进植株生长的效果，Anjum等发现枯草芽孢杆菌的施用增加了甜瓜植株根干重和茎重；枯草芽孢杆菌QST713可促进黄瓜植株生长，尤其是株高和干重的增加；此外，解淀粉芽孢杆菌GB03可促进木薯地上部和根系生长。
本研究以黄瓜茄病镰刀菌作为靶标真菌，从设施黄瓜根际抑病土中分离筛选对茄病镰刀菌有抑制效果的芽孢杆菌，对3个拮抗作用显著的菌株进行形态观察、生理生化分析和分子生物学鉴定以明确其分类地位，并对3个菌株进行了盆栽试验，探究其对黄瓜幼苗根腐病的防控效果及对植株生长特性的影响，为有效防控黄瓜根腐病发生和黄瓜产业可持续发展提供了有潜力的生防资源和理论依据。
1材料与方法
1.1材料
供试黄瓜品种为‘德尔99’，种子购买自天津德瑞特种业有限公司。土壤样品采集自宁夏中卫市及吴忠市日光温室设施黄瓜根际。供试黄瓜根腐病病原菌茄病镰刀菌（F.solani）由中国农业大学实验室提供。
培养基：NA培养基用于拮抗菌的分离和培养；PDA培养基用于真菌培养及拮抗细菌的筛选；PDB培养基用于病原真菌液体培养；LB肉汤培养基用于拮抗细菌的液体培养。
1.2方法
1.2.1芽孢杆菌的分离
称取10 g土壤样品至装有90 mL无菌水的三角瓶中振荡使之充分悬浮，悬浮液置于80℃水浴20 min以杀死绝大部分非芽孢杆菌，将土壤悬浮液稀释至10-3、10-4，10-5浓度，吸取100μL至NA平板涂布均匀，倒置于30℃恒温箱中培养2 d后，选择具有不同形态的菌落划线纯化3次。
1.2.2拮抗菌株的筛选
采用平板对峙培养法筛选出对黄瓜茄病镰刀菌有抑制作用的菌株。初筛：用直径为5 mm的打孔器在茄病镰刀菌平板边缘打取病原菌菌饼接入PDA平板中央，并在菌饼周围等距离25 mm处点接待测的菌株。以只接种病原菌作对照，重复3次，28℃培养7 d后记录病原菌直径并计算抑菌率。
选择初筛抑菌率高于50%的菌株使用其培养液进行复筛。将直径为5 mm的茄病镰刀菌菌饼接入PDA平板中央，然后在距中心25 mm处打孔，接入200μL细菌培养上清液（挑取一环纯菌接种在装有10 mL LB液体培养基三角瓶中，30℃、200 r/min培养24 h，10 000 r/min离心5 min）。以空白培养基作对照，重复3次，28℃培养7 d后记录病原菌直径，并计算抑菌率。
抑菌率（%）=（对照病原菌菌落直径-处理病原菌菌落直径）/（对照病原菌菌落直径-病原菌菌饼的初始直径）×100%
1.2.3拮抗菌株的鉴定
1.2.3.1菌株的形态学和生理生化鉴定
将复筛后拮抗效果最好的3个菌株划线在NA平板上置于30℃恒温培养箱中培养24 h，参照《常见细菌系统鉴定手册》进行菌落形态观察和生理生化等特征分析。
1.2.3.2菌株的抗病促生特性测定
固氮能力：将待测菌株接种到阿须贝培养基，培养观察其有无菌体生长。溶磷能力：将待测菌株接种于固体无机溶磷培养基平板，培养观察其有无透明溶磷圈出现。解钾能力：将待测菌株接种到硅酸盐培养基上，培养观察其有无透明圈出现。产铁载体：将待测菌株接种到铬天青CAS培养基上，培养观察有无黄绿色晕圈出现。ACC脱氨酶活性：将菌株接种到ADF液体培养基培养，将培养所得菌液涂布于ADF固体平板，30℃培养后观察ADF平板上有无菌落生长，有菌落生长则具有ACC脱氨酶活性，反之则无。根据要雅倩等的方法进行蛋白酶、果胶酶、几丁质酶、纤维素酶活性的检测。
1.2.3.3菌株的分子鉴定
挑取单菌落接种于LB肉汤培养基30℃培养24 h后，采用DNA提取试剂盒提取菌株的总DNA，使用细菌通用引物（27F:5'-AGAGTTTGATCATGGCTCAG-3'和1492R:5'-CTACGGCTA CCTTGTTACGA-3'）扩增各菌株的16S rDNA基因序列，PCR反应体系（50μL）：菌落（基因组DNA）1μL，上下游引物（27F和1492R）各1μL，ddH2O 22μL，MIX（2×Phanta Max Master Mix）25μL。PCR扩增反应条件：95℃预变性5 min；94℃变性30 s，55℃退火30 s，68℃延伸50 s，共35个循环；参照Cao等方法，使用特异性引物gyrA：（L-AAATCTGCCCGTATCGTCG,R-GCGTCACGGCGRATCTCAA）、rpoA：（L-CGTAGAGCCACTTGAGCG,R-CTGCCGTTACAGTTCCTT）进行基因扩增，扩增产物经1.5%琼脂糖凝胶电泳检测，PCR产物回收后送北京擎科生物有限公司进行测序。将测得的菌株序列在NCBI数据库中进行BLAST对比，使用MEGA 7软件构建系统发育树。
1.2.4菌株的促生试验
试验在中国银川市宁夏大学实训基地进行。育苗基质（河北德沃多肥料有限公司）的基本性质：pH 6.75，EC 0.91 mS/cm，有机质40.71 g/kg，全氮0.70 g/kg，速效氮27.44 mg/kg，速效磷15.43 mg/kg，速效钾66.97 mg/kg。基质连续灭菌（121℃，20 min）3次后降至室温备用。将消毒后的黄瓜种子温汤浸种催芽，待露白后播种至72孔穴盘，于幼苗两叶一心时用20 mL菌株培养液（108 CFU/mL）灌根处理，CK1为20 mL清水灌根，每个处理15株，重复3次，接种10 d后对植株的生长特性指标进行测定。
1.2.5菌株的盆栽防效试验
于幼苗两叶一心时分别先用20 mL拮抗菌培养液灌根处理，24 h后接种茄病镰刀菌悬浮液（104 CFU/mL），不同浓度的处理设置为CK2：20 mL清水灌根、T1：原液，浓度108 CFU/mL、T2：10倍稀释液，浓度107 CFU/mL、T3：100倍稀释液，浓度106 CFU/mL。每个处理15株，重复3次。接种10 d后对植株的生长特性指标进行测定，调查发病情况，病情分级标准参照文献，并计算病情指数和防病效果。
淀粉芽孢杆菌、枯草芽孢杆菌抑制茄病镰刀菌效果显著，可促进黄瓜幼苗生长（一）
淀粉芽孢杆菌、枯草芽孢杆菌抑制茄病镰刀菌效果显著，可促进黄瓜幼苗生长（二）