2结果
2.1茄病镰刀菌抗性菌株的分离与筛选
从采集的23份根际土壤中共分离纯化得到菌株343株，通过与黄瓜茄病镰刀菌的对峙培养，筛选出抑菌率在60%-70%的菌株5株（表1），50%-60%的菌株59株，192株菌株对茄病镰刀菌抑菌效果不佳。对抑菌率在50%以上的菌株编号并进行复筛。
表1分离菌株对黄瓜茄病镰刀菌的抑菌情况
复筛结果表明，菌株XY-1、XY-13、XY-53对茄病镰刀菌生长有明显的抑制效果，抑菌率分别为65.90%、66.13%和60.83%（表2）。
表2菌株培养上清液对黄瓜茄病镰刀菌的抑制效果
注：同列不同小写字母表示数据差异显著（P<0.05）
2.2茄病镰刀菌拮抗菌株的鉴定
复筛得到的3株拮抗效果最好的菌株在NA平板上均长势良好。菌落形态鉴定如表3。3株拮抗菌均为革兰氏阳性菌，菌体呈杆状，产椭圆形芽孢，如图1所示。
表3拮抗菌的形态及特征
图1菌株XY-1、XY-13及XY-53的菌落形态（A）、革兰氏（B）以及芽孢染色（C）形态
拮抗菌XY-1、XY-13和XY-53菌株的生理生化试验结果表明（表4），3个菌株在接触酶、氧化酶、明胶液化、乙酰甲基甲醇（V-P）、葡萄糖氧化发酵试验中呈阳性，在甲基红试验中呈阴性，XY-1、XY-13在淀粉水解试验中呈阳性，XY-53在淀粉水解试验呈阴性；抗病促生测试结果表明（表4），3个菌株均具有溶磷、固氮和产生ACC脱氨酶的能力，可以产生蛋白酶，均无解钾能力，不能产生铁载体、几丁质酶、果胶酶和纤维素酶。
表4 XY-1、XY-13、XY-53的生理生化特征及抗病促生特性测试结果
注：“+”表示阳性；“-”表示阴性
将3株拮抗菌的基因序列用BLAST比对后构建系统发育树（图2），构建16S rDNA系统发育树（图2-A），结果显示XY-1与解淀粉芽孢杆菌（登录号：ON287217.1）核苷酸序列比对相似度为99%，XY-13与解淀粉芽孢杆菌（登录号：MK521053.1）核苷酸序列比对相似度为98%，XY-53与枯草芽孢杆菌（登录号：641205.1）核苷酸序列比对相似度为100%；再构建gyrA、ropA系统发育树（图2-C和图2-D），结果显示XY-1与解淀粉芽孢杆菌（MK789290.1）核苷酸序列比对相似度为100%,故确定菌株XY-1为解淀粉芽孢杆菌；XY-13与解淀粉芽孢杆菌核苷酸（AJ832121.1）序列比对相似度为98%，故确定菌株XY-13为解淀粉芽孢杆菌；XY-53与枯草芽孢杆菌（登录号：MW287082.1）序列比对相似度为100%，故确定菌株XY-53为枯草芽孢杆菌。
图2菌株XY-1、XY-13及XY-53的系统发育树和特异性引物PCR电泳图
A：基于16S rDNA基因序列构建XY-1、XY-13及XY-53菌株系统发育树；B：XY-1、XY-13及XY-53菌株的ropA、gyrA基因序列的凝胶电泳；C：基于gyrA基因序列构建XY-1菌株系统发育树；D：基于ropA基因序列构建XY-13、XY-53菌株系统发育树
2.3抗性菌株的促生效果
盆栽试验表明，3株菌均可显著促进黄瓜幼苗株高、茎粗、叶绿素含量、地上部鲜重、地上部干重的增加，菌株XY-53的促生效果最好，XY-13次之（表5）。与对照（清水）相比，菌株XY-53处理后幼苗株高、茎粗、叶绿素含量、地上部鲜重、地上部干重、地下部干重均显著增加，分别增加了34.94%、7.91%、43.43%、51.52%、46.27%和37.70%。
表5菌株XY-1、XY-13、XY-53对黄瓜幼苗生长的影响
注： CK1、XY-1、XY-13、XY-53是不同的处理方式，分别代表黄瓜幼苗接种清水、XY-1、XY-13、XY-53。同列不同小写字母表示处理间差异显著（n=4，P< 0.05），下同
2.4抗性菌株的防病效果
将3株对黄瓜茄病镰刀菌拮抗效果较好的菌株进行了盆栽防效试验。结果（表6，图3）表明，3株芽孢杆菌对黄瓜根腐病均有较好的防控效果。不同菌株发酵液中菌含量不同时，防病效果差异明显，防效随接种浓度的增加而升高。其中枯草芽孢杆菌XY-53原液处理的防病效果最佳，为82.86%，解淀粉芽孢杆菌XY-1和XY-13分别为65.12%%、72.09%。
表6菌株XY-1、XY-13、XY-53对黄瓜根腐病的防治效果
图3菌株XY-1、XY-13、XY-53对黄瓜根腐病的盆栽防控效果
植株生长特性测定结果表明（表7），接种XY-1、XY-13、XY-53发酵液后再接种病原菌，黄瓜幼苗的株高、茎粗、叶绿素含量、地上部鲜重均显著高于CK2（只接种病原菌）。由此可见，施用芽孢杆菌XY-1、XY-13及XY-53菌种发酵液不仅能有效防控黄瓜苗期根腐病，还可以促进黄瓜幼苗生长。
表7菌株XY-1、XY-13和XY-53对黄瓜的促生效果
注： CK2、T1、T2、T3是不同的处理方式，CK2、T1、T2、T3分别代表黄瓜幼苗分别接种了清水、XY-1、XY-13、XY-53
3、讨论
植物根际存在大量的有益微生物，可以促进植株生长，提高植株抵御不良胁迫的能力。芽孢杆菌属菌株已被广泛接受为对抗多种植物病原体的有效BCAs，可作为杀菌剂防治黄瓜根腐病的替代选择。
本研究中，3株芽孢杆菌均表现出很好的BCAs潜力和PGPR活性。平板对峙试验中，解淀粉芽孢杆菌XY-1、XY-13和枯草芽孢杆菌XY-53可显著降低茄病镰刀菌的径向生长，这归因于芽孢杆菌产生的蛋白酶类物质，抑制了病原菌的增殖，发现枯草芽孢杆菌FJAT-14262产生的抗真菌脂肽可以抑制平板中尖孢镰刀菌菌丝的生长、解淀粉芽孢杆菌E3分泌的脂肽类物质可以抑制茄病镰刀菌孢子萌发和菌丝生长，芽孢杆菌FR9产生的蛋白酶（枯草杆菌蛋白酶A）可以抑制病原菌的生长，解淀粉芽孢杆菌LZN01分泌的抗菌物质可以抑制镰刀菌菌丝生长。生防菌株能否在植物根际或根部有效定殖是决定根部病害防治成功的关键一步。盆栽试验中，芽孢杆菌XY-1、XY-13和XY-53对黄瓜根腐病的防病效果随着接种浓度的升高而增加，浓度为108 CFU/mL时防效最高，与前人的研究结果一致，因为较高的菌液浓度使接种后位于根际的芽孢杆菌拥有较大的定殖基数，为产生更多的拮抗物质、与病原菌竞争空间营养进而有效防治根腐病奠定了物质基础，而盆栽试验中，接种病原菌后的幼苗叶片黄化，则是根腐病发病的症状之一，接种高浓度菌液的幼苗黄化程度弱于低浓度菌液，而低浓度菌液幼苗处理之间黄化差异不显著，这表明高浓度菌液对黄瓜根腐病的防效高于低浓度菌液。
PGPR定殖在植物根际，可以促进植株生长，3株芽孢杆菌在单独施用以及病原菌侵染条件下均可以促进黄瓜幼苗的生长，这表明3个菌株均能很好地定殖于植株根际，在根部占据有利生态位点，为防控黄瓜根腐病、促进幼苗生长提供了有利条件。在促生试验中，芽孢杆菌XY-1、XY-13和XY-53均可以显著促进黄瓜幼苗的生长，表现为对幼苗株高、茎粗、叶绿素含量和地上部生物量的显著促进。此外，XY-1、XY-13和XY-53可以在有效防控黄瓜根腐病的同时促进幼苗生长，分析其原因是菌株抗生作用和诱导植物系统抗性共同发挥作用的结果，与前人发现抗性芽孢杆菌可以防治土传病害，同时促进植株生长的结果一致。菌株的促生效果与其具有的溶磷能力、固氮能力和ACC脱氨酶活性有关。芽孢杆菌可以通过产生拮抗代谢物，如抗生素、降解酶、ACC脱氨酶、挥发性化合物和铁载体等参与拮抗菌的生物控制，间接促进植物生长，或通过溶解磷酸盐、生物固氮等提高植物根际养分的可利用性，直接促进作物生长，研究结果表明接种固氮、溶磷菌株可以增加土壤中速效氮、磷、钾的含量、改善土壤理化性质，促进作物的生长，含有ACC脱氨酶的根际细菌能促进植株生长。
芽孢杆菌XY-1、XY-13和XY-53具有良好的防病促生效果，为黄瓜茄病镰刀菌根腐病的生物防治提供了理论依据，也为芽孢杆菌的产业化开发提供了菌种资源。但对其防病效果的广谱性、及其在根际定殖的动态规律与代谢产物的研究、发酵工艺优化有待进一步明确，以便全面的发掘XY-1、XY-13和XY-53的防治潜力，进而研发出多功能的芽孢杆菌制剂。
4、结论
分离得到解淀粉芽孢杆菌XY-1、XY-13，枯草芽孢杆菌XY-53。接种XY-1、XY-13、XY-53可以显著促进黄瓜幼苗的生长，对黄瓜幼苗株高、茎粗、叶绿素含量、生物量累积有显著增加效果，对黄瓜根腐病防效达65.12%、72.09%和82.86%。XY-1、XY-13和XY-53，特别是XY-53可作为防控黄瓜苗期茄病镰刀菌根腐病、促进黄瓜幼苗生长有潜力的生物防治资源。
淀粉芽孢杆菌、枯草芽孢杆菌抑制茄病镰刀菌效果显著，可促进黄瓜幼苗生长（一）
淀粉芽孢杆菌、枯草芽孢杆菌抑制茄病镰刀菌效果显著，可促进黄瓜幼苗生长（二）