摘要：[目的]高温堆积发酵是酱香型白酒生产中的关键工艺环节，克罗彭斯特德菌属(Kroppenstedtia)是堆积酒醅中的优势细菌属，研究其生长和代谢特征对于理解堆积发酵的关键作用至关重要。
[方法]采用胰酪大豆蛋白胨(tryptic soy broth,TSB)培养基从酒醅中筛选克罗彭斯特德菌，通过形态学和16S rRNA基因测序确定其分类学地位，结合菌株纯培养及不同温度(45℃和50℃)下的高粱固态发酵实验，研究其生长和挥发性化合物代谢特征。
[结果]从酱香型白酒堆积酒醅中分离筛选到3株克罗彭斯特德菌，经鉴定为象牙色克罗彭斯特德菌(Kroppenstedtia eburnea)。液态培养时菌株K.eburnea 1613促进吡嗪类物质的产生，为对照的2.66倍。在固态发酵高粱中检出的挥发性化合物主要为醇类和酸类，总含量随发酵时间的推移而逐渐增加。50℃发酵高粱有利于醇类、酸类和吡嗪类物质的积累，而45℃下酯类物质含量较高。3株菌以高粱为基质进行固态发酵时主要代谢产物是苯乙醇和异戊酸，其中K.eburnea 1615在50℃下发酵15 d时苯乙醇和异戊酸含量最高，为(31.17±0.14)µg/g和(16.75±0.76)µg/g。菌株K.eburnea 6E22在50℃下发酵15 d时2,5-二甲基吡嗪含量最高，为(1.67±0.14)µg/g。菌株K.eburnea 1613在发酵15 d时己酸含量最高，为(3.74±0.19)µg/g。50℃下发酵高粱自身中醛酮类物质积累明显。偏最小二乘判别分析(partial least squares discrimination analysis,PLS-DA)显示，温度和时间对3株菌发酵高粱中挥发性化合物的组成有显著影响。
[结论]象牙色克罗彭斯特德菌有助于堆积发酵酒醅风味化合物的产生，特别是醇类、酸类和吡嗪类等酱香型白酒特征风味物质。
酱香型白酒以其香气幽雅细腻、酒体醇厚丰满著称，其生产工艺特点是“四高两长，一大一多”，即高温堆积，高温馏酒，高温发酵，高温制曲；生产周期长，储酒时间长；用曲量大，多轮次取酒。高温堆积发酵是酱香型白酒生产的关键工序，被称为是“二次制曲”过程，主要起到网罗环境中的微生物、生成重要酱香风味化合物或前体物质以及糖化发酵作用。
克罗彭斯特德菌属(Kroppenstedtia)是酱香型白酒大曲生产和酒醅堆积发酵过程中的优势细菌，相对丰度约为3.49%−41.73%。克罗彭斯特德菌属属于芽孢杆菌纲(Bacilli)的高温放线菌科(Thermoactinomycetaceae)，基于EzBioCloud数据库(https://www.ezbiocloud.net/identify)，目前该属有4个分类学地位明确的种，包括象牙色克罗彭斯特德菌(K.eburnea)、广州克罗彭斯特德菌(K.guangzhouensis)、肺克罗彭斯特德菌(K.pulmonis)和血克罗彭斯特德菌(K.sanguinis)，主要是从塑料表面、血液、土壤和脑脊液分离出来的，均为好氧耐热微生物，其中K.guangzhouensis最适生长温度为50℃，其余均为45℃。温度是影响酱香型白酒堆积发酵质量的重要因素，能反映堆积发酵过程是否正常，在堆积过程酒醅温度最高能达到50℃左右。
目前基于宏转录组学和宏基因组学研究发现，克罗彭斯特德菌属是酱香型白酒酿造过程脂肪酸生物合成的功能微生物。对6个轮次大曲酶编码基因进行功能注释发现，象牙色克罗彭斯特德菌编码α-淀粉酶，能参与大曲发酵过程的碳水化合物代谢。此外，斯皮尔曼相关性分析显示，在大曲发酵过程中克罗彭斯特德菌属与氨基酸、乙酸等风味物质呈显著正相关。然而，克罗彭斯特德菌属在菌株水平的代谢特性及其在酱香型白酒堆积过程中对风味的贡献尚不清楚。
因此，本研究采用传统分离培养手段从酱香型白酒堆积酒醅中分离、筛选克罗彭斯特德菌，结合冷场扫描电镜及测序手段鉴定其形态特征和分类学地位；在纯培养条件下研究菌株的生长和挥发性化合物代谢情况；最后，以酱香型白酒酿造原料红缨子高粱为基质进行15 d恒温固态发酵实验，探究克罗彭斯特德菌在不同温度(45℃和50℃)条件下挥发性化合物的产生情况。
1、材料与方法
1.1材料
1.1.1样品采集
本研究中所用的酒醅样品取自某酱香型白酒酒厂，分别取自酱香型白酒第三次堆积发酵的第1、4、9天的酒醅。每一个酒醅样品取自距离地面50 cm的堆积酒醅，取样深度为20 cm，三点取样，每个点取约50 g酒醅，混匀后放入无菌自封袋。放冰袋4℃保存，送回实验室进行后续微生物分离。
1.1.2主要试剂和仪器
叔戊醇(色谱级纯度)，Sigma-Aldrich公司；细菌基因组DNA提取试剂盒，南京诺唯赞生物科技股份有限公司；胰酪大豆蛋白胨(tryptic soy broth,TSB)培养基，青岛海博生物技术有限公司；气相色谱-质谱联用仪，安捷伦科技有限公司；定量PCR仪，ThermoFisher Scientific公司；Spark多模微孔板阅读器，Tecan公司；冷场扫描电镜，HITACHI公司。
1.1.3培养基
调研克罗彭斯特德菌属相关文献发现，常用TSB培养基作为筛选培养基。
TSB培养基(g/L)：胰蛋白胨17.0，氯化钠5.0，大豆蛋白胨3.0，磷酸氢二钾2.5，葡萄糖2.5。固体培养基需添加质量分数2.0%的琼脂粉。灭菌条件为115℃、20 min。
固态发酵高粱培养基：向250 mL锥形瓶中加入100 g红缨子高粱和80 mL去离子水，121℃灭菌30 min后，冷却至50℃备用。
1.2酒醅中微生物的分离筛选及鉴定
称取10 g堆积醅样品，添加到装有100 mL无菌生理盐水和适量玻璃珠的250 mL三角瓶内，45℃、180 r/min振荡30 min，静置10 min，待酒醅沉到瓶底后，获得菌悬液。取上清液进行梯度稀释(10−1−10−7)，取100µL菌悬液涂布在TSB固体培养基上，放置在45℃培养箱，恒温培养2−3 d。待菌落长出后，每隔一段时间挑选不同菌落形态的单菌落，分离纯化3次后接种到TSB液体培养基中，在恒温摇床上45℃、180 r/min培养2 d。取2 mL菌液，根据细菌DNA快速提取试剂盒的说明书，提取菌株DNA用于物种鉴定，同时取0.9 mL菌液转移到有0.9 mL 50%甘油的保种管里，置于−80℃冰箱保藏备用。
参照《伯杰细菌鉴定手册》和《常见细菌系统鉴定手册》的方法对克罗彭斯特德菌进行形态学和分子生物学鉴定。分子生物学鉴定以细菌的16S rRNA基因通用引物27F(5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′)和1492R(5′-GGTTACCTTGTTACGACTT-3′)对提取的菌株DNA进行PCR扩增。PCR反应体系(25µL)：DNA模板1µL，2×Taq Master Mix(南京诺唯赞生物科技股份有限公司)12.5µL，上、下游引物(10µmol/L)各1µL，加无菌ddH2O至25µL。PCR反应条件：95℃预变性7 min；95℃变性25 s，56℃退火30 s，72℃延伸20 s，35个循环；72℃延伸7 min。将PCR产物送至天霖生物科技无锡有限公司测序，将测序结果与EzBioCloud数据库中的模式菌株进行同源比对。利用MEGA 7软件基于邻近法(neighbor-joining)构建系统进化树，以暹罗芽孢杆菌(Bacillus siamensis)KCTC 13613T的16S rRNA基因作为外源菌序列。
1.3菌株生长代谢特性
1.3.1生长曲线测定
将菌株在固体TSB培养基上进行划线培养，挑选单菌落在液体TSB培养基中培养获得生长活力良好的种子液。以1%接种量转接到加有适量玻璃珠的装有100 mL TSB液体培养基的250 mL三角瓶中，每隔4 h采集发酵液用于分析生长和代谢特征，以未接种的培养基为对照，每组设置3个平行。
吸取200μL发酵液至96孔板中，使用酶标仪测量600 nm处OD值。采用微量pH计(METTLER TOLEDO公司)测定pH值。将传代3次的生长至对数生长期(OD600约为2.0)的菌液涂布在平板上，让菌长满整个平板。挑取菌体，用PBS缓冲液清洗3次，再用2.5%的戊二醛溶液固定2次，用冷场扫描电子显微镜观察菌体的微观形态。
1.3.2挥发性化合物测定
采用顶空固相微萃取-气质联用法(headspace solid-phase microextraction-gas chromatography-mass spectrometry,HS-SPME-GC-MS)测定菌液中挥发性化合物组成。取30 mL培养至平稳期的菌液于50 mL离心管中，4℃、8 000 r/min离心10 min。取5 mL上清液于20 mL顶空瓶中，加入2.3 g氯化钠以及10μL 8.05 g/L的色谱级叔戊醇内标液。
检测条件：色谱柱为DB-Wax毛细管柱(30 m×0.25 mm,0.25μm)，载气为He，流速为1 mL/min，进样口温度为250℃，解吸5 min，不分流进样；气相升温程序：初始温度40℃，保持3 min，以5℃/min升至60℃，再以10℃/min升至230℃，保持8 min。质谱条件：离子源温度260℃，界面温度200℃，电子能量70 eV，扫描质量范围25–350 amu。采用NIST17谱库进行定性分析，采用内标法计算各种物质的相对含量。
1.4菌株固态发酵高粱的产香特征分析
1.4.1不同温度条件下固态发酵高粱
菌株按1%的接种量接种于TSB液体培养基，培养至平稳期，4℃、8 000 r/min离心10 min收集菌体，利用PBS缓冲液洗涤菌体2次并重悬。向固态发酵高粱培养基中分别加入20 mL菌株重悬液，混匀后分别放入45℃和50℃的恒温培养箱中培养，以加入20 mL无菌水为空白对照，每个处理设置3个平行。在发酵第0、4、7和15 d时分别取样，置于−80℃冰箱备用。
1.4.2菌株固态发酵高粱的挥发性化合物测定
采用HS-SPME-GC-MS检测菌株在不同温度条件下发酵高粱的挥发性化合物组成。取5 g样品于50 mL离心管中，加入20 mL超纯水，充分涡旋振荡混匀，4℃超声处理30 min，8 000 r/min离心10 min。取5 mL上清液至20 mL顶空瓶中，加入2.3 g氯化钠以及10µL 8.05 g/L的色谱级叔戊醇内标液。HS-SPME-GC-MS运行程序与分析方法见1.3.2。
1.5数据分析
利用Microsoft Excel 2016、Origin 2021等软件对获得的原始数据进行处理，使用SIMCA 14.1软件对挥发性化合物进行多元统计分析，利用GraphPad Prism 8.0.2软件作图并对数据进行方差分析，使用派森诺云平台(https://www.genescloud.cn/login)进行挥发性物质聚类热图绘制，对每个挥发性化合物分别采用Z-score方法标准化。
酱香型白酒堆积酒醅中分离克罗彭斯特德菌生长和挥发性化合物代谢特征（一）
酱香型白酒堆积酒醅中分离克罗彭斯特德菌生长和挥发性化合物代谢特征（二）
酱香型白酒堆积酒醅中分离克罗彭斯特德菌生长和挥发性化合物代谢特征（三）