本文以水溶性苦荞蛋白为研究对象，利用体外模拟发酵，通过对苦荞蛋白作用下小鼠粪便发酵液中pH、短链脂肪酸(乙酸、丙酸、丁酸、乳酸)的含量以及有害菌(肠球菌、肠杆菌、产气荚膜梭菌)的数量进行测定，对苦荞蛋白抑制肠道有害菌群生长机理进行了初步研究。结果表明:添加不同浓度的苦荞蛋白与对照组相比，均可以有效降低有害菌的数量，其中高剂量组分别使肠球菌、肠杆菌和产气荚膜梭菌减少了65%、72%和78%(32 h);同时，不同剂量组的苦荞蛋白使小鼠粪便发酵液pH分别下降了35%、39%、40%(32 h)。此外，高剂量组的苦荞蛋白较对照组分别使乙酸、丙酸、丁酸及乳酸的浓度增加了8.94、33.77、27.34、25.55倍(32 h)。综上所述，苦荞蛋白能够提高肠道中短链脂肪酸含量，从而降低肠道环境的pH，抑制肠道有害菌(肠球菌、肠杆菌、产气荚膜梭菌)的生长。
肠道菌群被认为是机体的一个重要“器官”，其组成和数量在维持人体健康中起重要作用，且主要由益生菌和有害菌(条件致病菌和病原菌)组成。而有害菌是肠道中的非优势菌群，其在肠道中只占较少的比例，其中肠球菌、肠杆菌以及产气荚膜梭菌等是肠道中主要的有害菌，它们能够将食物中的一些成分变为多种腐败物质(如:胺、吲哚、酚类)、有毒及致癌物质(如:微生物毒素、硝基化合物)等，从而引起某些肠道疾病的发生。研究发现，花生蛋白对肠球菌、肠杆菌、产气荚膜梭菌的生长具有明显的抑制作用。目前，对于苦荞蛋白的研究主要集中在降低胆固醇、调节血脂以及其对益生菌增殖作用等方面，而对于其在肠道有害菌方面的研究则鲜有报道。
因此，本文以苦荞蛋白为研究对象，通过模拟结肠发酵进行体外培养，从苦荞蛋白对肠道有害菌(肠球菌、肠杆菌、产气荚膜梭菌)的生长的抑制影响、小鼠粪便发酵液pH以及短链脂肪酸(乙酸、丙酸、丁酸、乳酸)的含量三个方面研究其对肠道有害菌生长及抑制作用的机理。
1材料与方法
1.1材料
黑丰1号苦荞购于山西省左云县;SPF级C57BL/6小鼠45只购于上海斯莱克实验动物有限公司;L-半胱氨酸盐酸盐、胆盐、维生素K1、氯高铁血红素、刃天青、胃蛋白酶(≥3000 U/g)、胰酶(≥4000 U/g)、猪胆汁粉，均为BR级购于上海宝曼生物科技有限公司;伊红美蓝琼脂(EMB)、胰月示-亚硫酸盐-环丝氨酸琼脂基础、胆汁七叶苷叠氮钠、D-环丝氨酸、50%卵黄乳液购于青岛海博生物技术有限公司;乙酸、丙酸、丁酸、乳酸，均为色谱纯购于上海麦克林生化科技有限公司;酪蛋白、葡萄糖、蛋白胨、酵母膏，均为AR级购于国药集团化学试剂(上海)有限公司;其他试剂均为分析纯。
体外模拟基础培养基的制备(1 L):参考Mao Sheng-yong等人的方法，并略作修改。
PBS:磷酸盐缓冲液(Phosphate Buffered Saline)，分别配制0.01 mol/L和0.1 mol/L、pH7.0的PBS。其中将配制好的PBS(0.1 mol/L，pH7.0)经高压灭菌后，置于厌氧培养箱中37℃过夜，用于稀释肠道内容物。
1.2实验方法
1.2.1实验小鼠分组
SPF级C57BL/6小鼠购买后于SPF级动物房内单笼饲养，饲养温度(25±1.0)℃，湿度50%±1.0%RH，并喂食2周以适应环境。在此期间，自由进食和饮水(饮用水121℃、20 min灭菌，基础饲料和垫料紫外照射30 min杀菌)。然后，将小鼠随机分为五组，空白对照组喂食基础饲料，酪蛋白组喂食酪蛋白添加量1 mg/mL的饲料，其余三组小鼠按苦荞蛋白添加量1、3、5 mg/mL将小鼠分为低、中、高剂量组。
1.2.2苦荞蛋白的制备
参考郭晓娜等人的方法并略作修改。苦荞籽粒粉碎后过筛，脱脂24 h;取100 g脱脂苦荞粉以料液比1∶10用0.01 mol/L，pH7.0的PBS溶解，在磁力搅拌器上搅拌2 h;在4℃条件下，4000 r/min离心30 min，并向上清液中加入(NH4)2SO4使其浓度为40%，搅拌60 min;在4℃条件下，10000 r/min离心15 min，并向上清液中加入(NH4)2SO4使其浓度为80%，搅拌60 min;在4℃条件下，10000 r/min离心15 min，弃上清，沉淀用少量去离子水复溶;然后将其加入到透析袋中进行透析48 h(每4 h换水一次)，透析后进行冻干(-70℃，24 h)，冻干粉保存备用。
1.2.3苦荞蛋白含量的测定
参照国标GB 50095-2010中凯氏定氮法进行样品测定。
1.2.4肠胃道环境模拟
体外消化:参考Mills等人的方法并略作修改。具体如下:分别称取5.0 g苦荞蛋白，将pH调节到2.0±0.05(此时胃蛋白酶的活性最高)，加入2.5 mL溶解在0.1 mol/L盐酸中的胃蛋白酶溶液(0.108 g/mL)，经37℃恒温水浴震荡2 h;经过模拟胃部条件消化后，再用6 mol/L NaOH将溶液的pH调节到6.8±0.05(此时胰酶活性最高)，加入12.5 mL溶解在0.5 mol/L Na2CO3中的胰酶胆汁溶液(胰酶和胆汁浓度分别为4.5 mg/mL和28 mg/mL)，37℃恒温水浴震荡2 h;进一步模拟食物在肠道中的消化。充分混匀后，将混合液置于透析袋进行透析，并于37℃，在10 mmol/L NaCl溶液中进行透析过夜，结束后，再次更换NaCl溶液并继续透析2 h，最后将截留消化液进行冷冻干燥，于4℃冰箱保存用于体外模拟肠道发酵实验。上述步骤以酪蛋白(Casein)作为对照以及用无菌水代替苦荞蛋白作为空白对照。
1.2.5体外发酵液的制备
体外发酵:参考Estibaliz等人的方法，并略作修改。向无菌发酵瓶中加入90 mL基础培养基并于厌氧工作站中37℃进行预还原(12 h)。1 L基础培养基中含有:2 g葡萄糖，2 g蛋白胨，2 g酵母膏，0.1 g NaCl，0.04 g K2HPO4，0.04 g KH2PO4，0.01 g MgSO4·7H2O，0.01 g CaCl2·6H2O，2 g NaHCO3，0.5 gL-半胱氨酸盐酸盐，0.5 g胆盐，10 mL维生素K1，2 mL吐温-80和1 mL氯高铁血红素溶液，将以上成分溶解后调节基础培养基pH至7.0(±0.05)，最后加入4 mL 0.025%(w/v)刃天青溶液并灭菌。
收集小鼠新鲜粪便(尽量保持无菌状态)，收集后立即用预还原的磷酸盐缓冲溶液(PBS，0.1 mol/L，pH7.0)稀释10倍，并在涡旋振荡器上充分振荡3 min，使之彻底匀浆化，500 r/min离心2 min，分别迅速取上清液10 mL到90 mL预还原基础培养基中，再加入低(0.2 g)、中(0.4 g)、高剂量组(0.8 g)经胃肠模拟环境处理后的苦荞蛋白水解样品BWPH(酪蛋白消化冻干样品PC作为对照组，无菌水代替苦荞蛋白的消化冻干产物CK作为空白对照)充分混匀;在厌氧培养箱中37℃发酵32 h，并在发酵的第0、8、16、32 h取样。
1.2.6苦荞蛋白对三种有害菌生长的影响
在发酵的第0、8、16、32 h，分别取小鼠粪便发酵液并对其中的肠球菌、肠杆菌、产气荚膜杆菌进行计数，发酵液用含有5 g/L蛋白胨的稀释液进行10倍梯度法稀释(10-1～10-7)，选择合适稀释度的样品(100μL)并分别涂布于各选择性培养基上进行培养(培养基、培养方法及条件，见表1)，以上操作均在厌氧培养箱中进行，从取样至涂板完成所用时间控制在3 h内。每毫升小鼠粪便发酵液的菌落数用菌落形成单位的以10为底的对数值(lg CFU/mL)表示。
表1肠道主要菌群培养计数方法
1.2.7苦荞蛋白对发酵液pH的影响
在发酵的第0、8、16、32 h，分别取不同样品小鼠粪便发酵液，用pH计测定其pH。
1.2.8苦荞蛋白对短链脂肪酸的影响
短链脂肪酸(SCFAs)是肠道微生物发酵不被人体胃肠道吸收的食物成分而生成的代谢产物，主要包括甲酸、乙酸、丙酸、丁酸、乳酸、延胡索酸和一些相应的支链脂肪酸。其中乙酸、丙酸、丁酸及乳酸占90%以上，具有重要的生理功能。为进一步研究苦荞蛋白对肠道有害菌群生长抑制作用的机理，实验对小鼠粪便发酵液中短链脂肪酸(SCFAs)的浓度变化进行分析。
在发酵的第0、8、16、32 h，分别取不同样品小鼠粪便发酵液，采用气质联用(GC-MS-MS)法测定其中短链脂肪酸(SCFAs，包括乙酸、丙酸、丁酸、乳酸)的含量。
气质分析条件:毛细管柱(Rtx-5MS，30 m×0.25 mm×0.25μm);柱温:35℃保持1 min，以10℃/min的速度升温至100℃，保持1 min，再以20℃/min的速度升温至250℃，保持3 min;进样口温度:250℃;离子源温度:220℃;接口温度:260℃;分流方式及分流比:分流进样和10∶1;载气:He，流速:1 mL/min;溶剂延迟1.5 min。GC分析时进样量:1μL。
发酵液样品的处理参考Fenster等人的方法，并略作修改。
1.2.9数据分析
采用SPSS 20.0软件进行ANOVA(LSD检验)，检验水准=0.05进行显著性分析;每组数据均作3个平行样，结果以平均值±标准差表示，并运用origin 9.0软件进行作图。
苦荞蛋白对肠球菌、肠杆菌、产气荚膜梭菌生长抑制作用及机理（一）
苦荞蛋白对肠球菌、肠杆菌、产气荚膜梭菌生长抑制作用及机理（二）
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