摘要:目的探讨人工阅读DL-Bt64血培养系统不典型生长曲线在鉴别血培养假阴性标本中的临床应用价值。方法将常见的生长曲线分为I~Ⅲ型，并以盲种培养法作为判定真阴性和假阴性的“金标准”。选取2180瓶经全自动血培养仪判读为阴性的静脉血培养物标本，通过分析采血量和患者的抗生素应用史，探讨不典型生长曲线及假阴性的形成原因。进一步采用A(抽取培养物，涂片并革兰染色)和B(人工阅读并分析各种不典型生长曲线)两种方法筛查假阴性标本，通过比较两种方法的敏感性，特异性、准确率和阳性预测值，评估方法B的临床应用价值。结果﹐2180瓶培养物中，用“金标准”方法共检出110瓶假阴性标本，其余2070瓶为真阴性标本。99.09%(109/110)的假阴性标本的生长曲线不典型，且97.27%(107/110)的不典型生长曲线与采血量不符合要求或滥用抗生素有关。79.09%的假阴性标本生长曲线延迟抬头，符合Ⅲ型。方法A与“金标准”方法结果完全一致。方法B筛选出140瓶疑似假阴性标本，经“金标准”方法确认，109瓶为假阴性，31瓶为真阴性;其余2040瓶标本经“金标准"方法确认，l瓶为假阴性，2039瓶为真阴性。方法B的敏感性(99.09%)和特异性(99.95%)与方法A相比差异无统计学意义(X值分别为0.90和2.01，P>0.05)。方法B的准确率(98.53%)和阳性预测值(77.86%)显著低于方法A(X值分别为32.13和54.23，P<0.01)。结论绝大多数假阴性标本的生长曲线不典型，与采样量不符合要求或抗生素滥用有关。通过人工阅读细菌生长曲线，能够高效筛选假阴性标本。
目前临床上常用于鉴别假阴性的方法是培养物盲种法和涂片镜检法，但对每例阴性标本都进行盲种培养和涂片镜检，工作量巨大，且无法满足目前的临床需求。本研究旨在分析导致血培养标本假阴性的影响因素，探讨人工阅读不典型生长曲线鉴别血培养假阴性标本的临床意义，报告如下。
1材料与方法
1.1仪器与试剂
DL⁃Bt64型全自动血培养仪和配套培养瓶、SCAN⁃10全自动细菌加样仪、DL⁃96Ⅱ型全自动细菌检定仪和配套的体外鉴定板条，90mm血平板和巧克力平板(上海科科玛嘉生物技术公司)，快速格兰染色试剂盒。
1.2研究对象
收集2020年1月至2022年12月徐州市铜山区人民医院ICU、脑外科、胸外科及呼吸科就诊的高热患者1228例，男520例，女708例，年龄18~92岁，中位年龄55岁。要求临床医护人员在使用抗生素之前采集双侧或单侧静脉血，分别注入需氧血培养瓶，每瓶8~10mL。纳入标准:采血时体温≥38.5℃，年龄≥18岁，且血培养仪自动判读为阴性的标本。排除标准:(1)年龄<18岁;(2)血培养仪自动判读为阳性的标本。根据厂家说明书，将DL⁃Be64型全自动血培养仪参数设置如下:阳性阈值为350反射单位(Reflectanceunits，Runit)，有瓶最小值为100Runit，报警频率为2300Hz，报警时长为300ms，培养时间5d，生长曲线突破阳性阈值线时判读为阳性。共收集到血培养仪判读为阴性的样本2180瓶，经盲种培养法确认，2070瓶为真阴性，110瓶为假阴性。查询患者病历，110瓶假阴性标本中，有85瓶在采样前经验性输注了抗生素。抗生素使用情况见表1。
1.3方法
1.3.1盲种培养法
使用无菌注射器从阴性培养瓶中抽取0.1~0.2mL培养物，分别转种于血平板和巧克力平板，在35℃、5%CO2条件下培养48h。若无细菌生长，判为真阴性;若有细菌生长，判为假阴性，挑取部分菌落，涂片并经革兰染色后使用显微镜观察细菌形态。以此结果作为判断真阴性和假阴性的“金标准”。挑取适量菌落，根据厂家说明书配制菌液并加入至相应鉴定和药敏板条中，在35℃、5%CO2条件下培养18~24h，采用DL⁃96Ⅱ细菌鉴定仪鉴定菌种并检测最小抑菌浓度(mini⁃muminhibitoryconcentration，MIC)值。
表1假阴性标本采样前抗生素使用情况
1.3.2方法A
检测全自动培养结束后，取出阴性培养瓶，使用75%酒精进行灭菌处理。使用无菌注射器抽取适量培养物涂于洁净玻片上，经革兰染色后采用油镜观察，若检出细菌则判定该瓶培养结果为假阴性。
1.3.3方法B
检测采用人工阅读DL⁃Bt64型全自动血培养生长曲线，将常见的生长曲线分为Ⅰ~Ⅷ型(图1)。其中Ⅰ型:生长曲线呈平直状，处于阈值线以下，是典型的阴性曲线;Ⅱ型:生长曲线呈“S”形，突破阈值线，有明显的对数生长期，是典型的阳性曲线;Ⅲ和Ⅳ型:生长曲线起始点位于阈值线下方，呈“S”形抬头，但是未能突破阈值线;Ⅴ和Ⅵ型:生长曲线起始点均在阈值线之上，其中Ⅴ型呈“S”形抬头，但很快进入平台期，而Ⅵ型呈水平直线状;Ⅶ和Ⅷ型:生长曲线起始点处于阈值线下方或上方，呈直线斜向上，无明显迟缓期、加速期和对数生长期。其中，Ⅰ和Ⅱ型是典型的生长曲线，易被监测系统识别，而Ⅲ~Ⅷ型生长曲线难以被监测系统识别，不能排除瓶内有细菌生长的可能，称为“不典型生长曲线”。根据目测采血量和抗生素滥用情况以及细菌药敏结果，分析各种不典型生长曲线的形成原因。
注:Runit，反射单位;Ⅰ和Ⅱ型为常见的典型生长曲线;Ⅲ~Ⅷ为不典型生长曲线。
图1方法B检测各种类型的生长曲线
1.4方法
A、B的筛选效能评价及统计学分析采用SPSS21.0统计学软件和χ2检验比较方法A和B的准确率、特异性、敏感性和阳性预测值，以P<0.05为差异有统计学意义。