2结果
2.1真阴性与假阴性标本的生长曲线分布
2180瓶标本经“金标准”确认，110瓶为假阴性，假阴性率为5.05%，其中99.09%(109/110)符合Ⅲ~Ⅷ型，79.09%(87/110)符合Ⅲ型生长曲线，2.73%(3/110)符合Ⅳ型，17.27%(19/110)符合Ⅴ或Ⅵ型，仅0.91%(1/110)符合Ⅰ型。2070瓶真阴性标本中98.50%(2039/2070)符合Ⅰ型，1.50%(31/2070)符合Ⅵ、Ⅶ和Ⅷ型。见表2。
2.2采血量不规范和抗生素滥用与不典型生长曲线的关系
99.47%(2059/2070)真阴性标本的生长曲线符合Ⅰ型，目测采血量正常，其余0.53%(11/2070)真阴性标本符合Ⅵ型，目测采血量均明显过多。97.27%(107/110)的假阴性标本采血量不符合要求或在采样前使用了抗生素，2.73%(3/110)的假阴性标本采血量基本符合要求，采样前也未使用抗生素。见表3。
表3110瓶假阴性标本的抗生素使用情况、采血量和生长曲线类型(n)
注:a，头孢吡肟钠;b，头孢曲松钠+左氧氟沙星;c，氨苄西林+头孢曲松钠;d，青霉素钾;e，克林霉素磷酸酯+左氧氟沙星;f，未用抗生素。
2.3细菌耐药分析
采样前使用抗生素的85瓶假阴性标本中共培养出细菌85株，包括肺炎克雷伯菌25株、鲍曼不动杆菌18株、大肠埃希菌15株、醋酸钙不动杆菌14株和金黄色葡萄球菌13株，其对头孢吡肟、头孢曲松、左氧氟沙星、氨苄西林、青霉素和克林霉素的耐药率均较高。见表4。
表4使用抗生素的假阴性标本的细菌耐药率(%)
2.4A、B两种方法的筛选效能比较
以方法A为参考，分析方法B对假阴性标本的筛选效能。方法A结果与“金标准”方法完全一致，其准确率、特异性、敏感性和阳性预测值均为100.0%。方法B筛选出140瓶阳性和2040瓶阴性，109瓶阳性和2039瓶阴性与“金标准”方法均相符。方法B的敏感性和特异性与方法A比较差异无统计学意义(χ2值分别为0.90和2.01，P均>0.05)，但其准确率和阳性预测值低于方法A(χ2值分别为32.13和54.23，P均<0.01)。见表5。
3讨论
目前全自动血培养仪的应用越来越普及，但其假阴性是一个常被忽略的问题，假阴性率的高低与仪器的性能有关，不同类型的血培养仪因检测原理不同，性能差别也较大。已知血培养仪的检测原理有4种:
(1)电导法，根据在细菌生长过程中引起的导电性能变化检测细菌生长;
(2)压力监测法，细菌生长过程中会消耗氧气，产生CO2，引起压力变化;
(3)荧光法，包括荧光递增检测法和荧光递减检测法;
(4)比色法，大多数细菌和真菌在生长过程中会产生CO2，与瓶底显色物质反应，引起颜色改变，该方法结果重复性好和成本低，应用最广泛，DL⁃bt64血培养仪采用的就是该法。上述所有类型血培养仪的共同缺点是瓶内的抗生素易导致假阴性。除此之外，比色法血培养仪还有血细胞自身代谢产生的CO2易干扰细菌生长监测等缺点。因此，在排查假阴性原因时，需要考虑拮抗剂对抗生素的拮抗能力、培养瓶的性能、滥用抗生素以及采血量是否符合厂家说明书要求等因素。鉴别假阴性的传统方法是培养物盲种法(“金标准”)或培养物涂片法，虽准确度高，但效率低，工作量巨大。假阴性标本的生长曲线难以被监测系统识别，被称为“不典型生长曲线”，但可以通过人工识别。因此，人工阅读不典型生长曲线有望成为快速筛选假阴性标本的新方法。
表5A、B两种方法的筛选效能比较
此外，笔者在分析Ⅲ型不典型生长曲线的形成原因时发现，Ⅲ型曲线的特点是延迟抬头，本研究中79.09%的假阴性标本符合Ⅲ型。标本中含有抗生素，可以导致细菌生长迟缓。尽管培养瓶中含有吸附性树脂，但尚未被吸附的低水平抗生素仍能影响细菌生长速度。培养瓶中细菌浓度过低，或采样量过少，经过较长时间繁殖增长后才能进入对数生长期，影响检测结果。某些苛养菌或兼性厌氧菌在体外生长缓慢或培养困难，也可以导致细菌生长曲线难以突破阈值。在本研究中，采样前使用抗生素的标本分离到的细菌耐药性较高，原因可能是抗生素浓度未达到细菌的杀菌浓度，诱导细菌产生了耐药性。
耐药性细菌在低浓度抗生素环境下仍能缓慢生长，但在设定的培养时间内无法突破阈值，可以形成Ⅲ型生长曲线。部分标本在采样前未使用抗生素，但生长曲线也符合Ⅲ型，进一步分析后发现采样量过少，导致细菌浓度低，生长缓慢，生长曲线无法突破阈值，这与已有的报道结果相符。Ⅳ型曲线的特点是起点位于阈值线下，多在2~3d内抬头，但始终无法突破阈值。某些菌株的CO2产量低，或瓶底显色模块中的指示剂变质，均可能导致生长曲线进入平台期后仍无法突破阈值，形成Ⅳ型生长曲线。本研究中2.73%的假阴性标本的生长曲线符合Ⅳ型，采血量符合规范，也未发现抗生素滥用，是否与CO2产量少或显色模块指示剂质量有关，其原因还需要进一步研究。Ⅴ和Ⅵ型生长曲线的共同特点是起始点高于阈值线，提示上机前瓶内已经产生了较多的CO2，将瓶底显色底物大部分或完全消耗。
从本研究中的表2和表4可以看出，在采血量过多时，无论真阴性还是假阴性，以及是否滥用抗生素，均有可能将显色物质提前耗尽，形成Ⅵ型生长曲线。部分假阴性标本符合Ⅴ型生长曲线，可能是由于显色底物未被血液标本自身耗尽，细菌的生长仍然可以形成“S”形，但由于抗生素的抑制作用或剩余的显色底物过少，曲线的变化速率较低，被仪器误识别为阴性。
本研究中有17.27%的假阴性标本的生长曲线符合Ⅴ型或Ⅵ型，采血量均过多。当然，Ⅵ型生长曲线尚不能排除标本中细菌起始量过多的因素。Ⅶ型和Ⅷ型生长曲线不具备细菌生长的“S”形特点，原因可能是过多的血液细胞代谢产生的CO2所致。本研究中未见符合Ⅶ型和Ⅷ型生长曲线的假阴性标本。部分真阴性标本符合Ⅶ型或Ⅷ型，可能与采血量过多有关。
此外，本研究中1例假阴性标本符合Ⅰ型生长曲线，患者在采样前使用了抗生素，可能因为培养瓶中抗生素浓度较高，导致在培养期间生长曲线不抬头，由于耐药性，细菌仍保持一定的活性，故而被“金标准”方法检出，但不能通过生长曲线将其与真阴性标本相鉴别。假阴性的主要原因是产生的CO2过多或过少，导致生长曲线无法满足仪器判读要求，与典型的阴性或阳性生长曲线区别明显。
本研究对2180例阴性血培养标本进行汇总分析，发现99.09%的假阴性标本为Ⅲ~Ⅷ型不典型生长曲线，因此尝试采用人工阅读生长曲线来鉴别假阴性，该方法在国内外尚未见报道。笔者分析后发现，该方法漏检了1例假阴性，漏检率仅为0.91%，准确率、特异性和敏感性均在98%以上，完全能够满足临床需求。该方法的阳性预测值仅为77.86%，低于培养物涂片法。因涂片法的结果与“金标准”完全一致，可以使用涂片法弥补该法阳性预测值低的缺点。通过人工阅读生长曲线将疑似假阴性瓶快速筛选出来，再通过涂片法确认，相比于对全部阴性标本进行盲种培养或涂片镜检，大大降低了工作量，值得推广。综上所述，滥用抗生素、采血量过多或过少可以导致假阴性的形成，虽然大多数品牌的培养瓶中已经添加了树脂或活性炭，但对抗生素的吸附能力有限，不能完全消除假阴性。
通过人工阅读不典型生长曲线，敏感性、准确率和特异性接近涂片法，能够高效筛选疑似假阴性标本，亦能辅助查找假阴性原因，值得推广。此外，该法阳性预测值偏低的缺点，可以通过涂片法弥补。由于大多数血培养仪都采用比色法监测细菌生长，因此，本研究的结果对其他同类血培养仪也有很高的参考价值。