1材料与方法
1.1材料
1.1.1植物和病原菌
桑枝：2022年秋采自重庆市蚕业科学技术研究院(29°48′58″N，106°24′51″E)，桑树品种为抗性品种‘川桑7637’。
病原菌：S.sclerotiorum PZ-2为本实验室分离保存，Botryotinia fuckeliana、Colletotrichum gloeosporioides、Colletrichum lagenarium、灰霉病菌(Botrytis cinerea)、旋孢腔菌(Cochiobolus sativus)、Thanatephorus cucumeri、大丽轮枝菌(Verticillium dahliae)、立枯丝核菌(Rhizoctonia solani)等为实验室收集保存菌株。
1.1.2培养基
LB培养基(g/L)：胰蛋白胨10.0，酵母粉5.0，NaCl 10.0，琼脂15.0–20.0。
马铃薯葡萄糖琼脂(PDA)培养基(g/L)：马铃薯200.0，葡萄糖20.0，琼脂15.0–20.0。
PDB培养基(g/L)：马铃薯200.0，葡萄糖20.0。
胰酪大豆胨琼脂(tryptone soya agar,TSA)培养基(g/L)：胰蛋白胨15.0，大豆胨5.0，NaCl 5.0，琼脂15.0–20.0。
营养琼脂(nutrient agar,NA)培养基(g/L)：蛋白胨10.0，牛肉膏3.0，NaCl 5.0，琼脂15.0–20.0。
R2A琼脂培养基(g/L)：细菌蛋白胨0.5，可溶性淀粉0.5，酵母粉0.5，葡萄糖0.5，酸水解酪蛋白0.5，KH2PO4 0.3，丙酮酸钠0.3，MgSO4 0.024，琼脂15.0–20.0。
以上培养基均采用121℃灭菌20 min。
1.1.3主要试剂
KI-I2染液：60 mg/mL KI溶液与10 mg/mL I2溶液以体积比1:1混合。
200 mmol/L 4-羟乙基哌嗪乙磺酸(4-hydroxyethyl piperazine ethane sulfonic acid,HEPES)的配制：用1 mol/L NaOH溶液将1 mol/L HEPES溶液pH调至6.8–8.2，向20 mL 1 mol/L HEPES中加入80 mL水，得到200 mmol/L HEPES。
1.2桑树内生拮抗菌的分离及筛选
1.2.1内生菌分离纯化
利用植物组织培养法分离内生菌，具体方法：取健康的‘川桑7637’枝条，剪至5–6 cm长，置于75%乙醇中浸泡1–2 min，取出后于酒精灯火焰上燃尽表面乙醇，置于PDA培养基表面滚动数圈后28℃条件下培养，以验证表面灭菌是否彻底。随后用无菌刀片将其分三层，分别置于LB、TSA、NA、R2A培养基上28℃条件下培养，待植物组织周围长出菌落后，通过平板划线法分离纯化内生细菌。
1.2.2桑椹菌核病拮抗菌初筛
利用平板对峙法筛选对S.sclerotiorum PZ-2有拮抗效果的内生菌。用打孔器取直径8 mm的S.sclerotiorum PZ-2菌饼，接种于培养基中央，在距中央2.5 cm处的4个方向分别划线接种不同内生菌，28℃培养，观察病原菌生长情况，筛选对S.sclerotiorum PZ-2具有拮抗效果的内生菌。
1.2.3桑椹菌核病拮抗菌复筛
对初筛拮抗效果较好的拮抗菌进行平板对峙法复筛。用打孔器取直径5 mm的S.sclerotiorum PZ-2菌饼，接种于培养基中央，在距中央2 cm两侧对称处划线接种拮抗菌，以只接种病原菌的平板为对照，25℃培养4 d，测量与待测细菌划线垂直方向的病原真菌菌落直径，设置3个重复，并按公式(1)计算抑菌率。
抗菌率（%）=（对照组菌落直径-实验组菌落直径）/（对照组菌落直径-菌饼直径）*100 公式(1)
1.3桑椹菌核病拮抗菌的鉴定
1.3.1形态学及生理生化特征鉴定
利用平板划线法将筛选获得的拮抗菌接种于PDA和LB培养基上，37℃培养12 h，观察其菌落形态。在LB上培养24 h和48 h后，分别进行革兰氏染色和芽孢染色。生理生化特征检测采用新型微生物微量生化鉴定管试剂盒(广东环凯微生物科技有限公司)。
1.3.2基于16S rRNA基因序列的系统发育分析
提取目的菌株基因组，在1.5 mL离心管中加入30μL DNA提取液(PrepMan Ultra Sample Preparation Reagent试剂盒)(Applied Biosystems公司)，挑取适量菌落与DNA提取液混合均匀，100℃金属浴10 min，之后12 000 r/min离心3 min，取20μL上清液作为模板备用。
以目的菌株基因组为模板，利用16S rRNA基因通用引物27F(5′-AGAGTTTGATCCTGGC TCAG-3′)和1492R(5′-GGTTACCTTGTTACGA CTT-3′)扩增拮抗菌16S rRNA基因序列。PCR反应体系：上、下游引物(10μmol/L)各1μL，DNA模板1μL，2×Rapid Taq Master Mix 12.5μL，ddH2O 9.5μL。PCR反应条件：95℃3 min；95℃15 s，55℃15 s，72℃30 s，30个循环。将PCR扩增产物送至生工生物工程(上海)股份有限公司测序，将获得的基因序列在NCBI数据库(https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi)中进行比对，并利用MEGA 5.0软件基于16S rRNA基因序列构建系统发育树。
1.4拮抗菌抑菌谱测定
以实验室保存的常见植物病原菌为靶标菌，用打孔器取直径为5 mm的菌饼，接种于培养基中央，在距离中央2 cm处左右两侧接种拮抗菌，每个处理设置3个重复，25℃培养，参照公式(1)计算抑菌率。
1.5拮抗菌对桑椹菌核病的离体防效实验
微调后进行离体防效实验。
1.5.1菌悬液及发酵上清液制备
挑取拮抗菌单菌落接种于10 mL LB液体培养基中，37℃、180 r/min培养过夜，将种子液接种至100 mL LB液体培养基，37℃、180 r/min培养过夜后，将发酵液12 000 r/min离心3 min收集菌体，用无菌水重悬到OD600为0.6(108 CFU/mL)制成菌悬液。
将拮抗菌接种到LB液体培养基，37℃、180 r/min振荡培养4 d，取发酵液12 000 r/min离心30 min后，上清液过0.22μm滤膜，获得无菌发酵上清液。
1.5.2离体防效实验
将新鲜桑椹置于75%乙醇浸泡20–30 s，无菌水洗去乙醇，无菌滤纸吸干水分；无菌针头刺破桑椹后分别在纯水、LB液体培养基、拮抗菌菌悬液、拮抗菌发酵上清液、甲基硫菌灵(稀释750倍)中浸泡30 min，取出置于培养皿自然晾干，取3块直径为8 mm的S.sclerotiorum PZ-2菌饼接种在桑椹上针头刺破处，保鲜膜包裹后放入组培瓶，室温(15–20℃)静置培养。每个处理设置5个生物学重复，每个生物学重复包含5个桑椹。室温培养2 d后取下保鲜膜，去除菌饼，观察记录并按公式(2)计算病情指数，菌悬液处理组和甲基硫菌灵以纯水为对照，发酵上清液处理组以LB液体培养基为对照，均按公式(3)计算防效。
根据处理后桑椹发病时的表面菌丝覆盖率，将发病桑椹进行分级：0级，无发病桑椹；1级，桑椹表面菌丝覆盖率0%–25%；2级，桑椹表面菌丝覆盖率25%–50%；3级，桑椹表面菌丝覆盖率50%–75%；4级，桑椹表面菌丝覆盖率75%–100%。
1.6拮抗菌抑菌机理初探
1.6.1拮抗菌发酵上清液对病原菌菌丝生长抑制作用
将拮抗菌接种到PDB培养基中，37℃、180 r/min培养4 d后，取发酵液12 000 r/min离心30 min，随后上清液过0.22μm滤膜，获得无菌发酵上清液。
利用菌丝生长速率法测定拮抗菌无菌发酵上清液对桑椹菌核病原菌S.sclerotiorum PZ-2的抑制效果。将病原菌S.sclerotiorum PZ-2分别接种至含有50%、20%、10%、5%、3%和2%拮抗菌无菌发酵上清液的PDA平板，25℃培养48 h，以未添加无菌发酵上清液的PDA平板为对照，参照公式(1)计算抑菌率，并在显微镜下观察S.sclerotiorum PZ-2菌丝形态。
1.6.2拮抗菌对病原菌糖原积累的影响
通过糖原染色测定拮抗菌对病原菌糖原积累的影响。在铺有玻璃纸的PDA平板中央接种直径5 mm的S.sclerotiorum PZ-2菌饼，距中心2 cm处两侧接种拮抗菌，取25℃对峙培养1、2、3、5 d后的S.sclerotiorum PZ-2菌丝置于载玻片上，用KI-I2染液染色1 min后盖上盖玻片，置于显微镜下观察，颜色越深代表菌丝糖原含量越多。以在PDA平板上培养相同时间的S.sclerotiorum PZ-2作为对照。
1.6.3拮抗菌对病原菌胞内活性氧的影响
采用DCFH-DA活性氧荧光探针测定对峙培养1、2、3、5 d的S.sclerotiorum PZ-2菌丝内活性氧含量。将S.sclerotiorum PZ-2菌丝置于200 mmol/L HEPES缓冲液中静置浸润20 min后，转移至15μmol/L的DCFH-DA溶液(北京鼎国昌盛生物技术有限责任公司)，25℃黑暗标记1 h，制片，置于荧光显微镜下观察，激发波长495 nm，发射波长515 nm。
1.6.4拮抗菌对病原菌基因表达的影响
根据1.6.1、1.6.2和1.6.3实验结果，利用实时荧光定量PCR检测拮抗菌对S.sclerotiorum PZ-2基因组中糖代谢、抗氧化酶和细胞壁成分相关基因表达情况的影响。
按1.6.2方法收集病原菌菌丝，依据Omega Fungal RNA Kit R6840(Omega Bio-Tek公司)说明书提取S.sclerotiorum PZ-2菌丝总RNA。
利用一步反转试剂盒(南京诺唯赞生物科技股份有限公司)将RNA反转为cDNA。反转体系：5×All-in-one qRT SuperMix 4μL，Enzyme Mix 1μL，RNA template 1μg，RNase-free ddH2O补足20μL。反应程序：50℃15 min；85℃5 s。
参考NCBI数据库(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/)中S.sclerotiorum基因组选取与糖代谢有关的基因Gene_9536(己糖激酶)、Gene_3455(糖基转移酶家族20)、Gene_7772(葡萄糖磷酸变位酶)，与病原菌抗氧化相关的基因Gene_5305(过氧化氢酶相关的免疫反应性)、Gene_4935(过氧化氢酶)、Gene_1287(过氧化物酶体)，与细胞壁组分合成相关的基因Gene_13(糖基转移酶、纤维素酶)、Gene_11361(几丁质合成酶2)、Gene_622(细胞壁)。利用软件Primer 5设计以上基因引物，内参基因和各基因的引物序列如表1所示。
表1.实时荧光定量PCR检测病原菌基因表达的引物序列
实时荧光定量PCR：每个样品设置3个生物学重复，每个生物学重复含3次技术重复。反应体系：TB Green Premix Ex Taq II(2×)10µL，正、反向引物(10µmol/L)各0.8µL，cDNA模板5µL，RNase-free ddH2O 3.4µL。反应程序：95℃30 s；95℃10 s，40个循环；60℃30 s。
1.7数据统计及分析
数据均采用Excel 2018进行分析计算，利用GraphPad Prism 8中t检验对相对基因表达量进行显著性分析并作图。
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