2.2重组病毒的制备、纯化和鉴定
2.2.1重组病毒的筛选
用质粒小提中量试剂盒提取高纯度转移载体质粒pT-UL2-RFP，将质粒浓缩为1μg/μL后，将该转移质粒载体与DEV共转染CEF，24 h后，即可在荧光显微镜下观察到带有红色荧光的的梭形细胞，说明质粒在该细胞中表达，待80%细胞产生病变后，收获细胞并反复冻融3次，将其接种到长有新鲜CEF单层的六孔培养板中，用含5%血清、3%NaHCO3、1%双抗、1%琼脂的M199培养液覆盖，观察荧光，挑取单个有红色荧光的蚀斑，再接种到新的细胞上，经过5轮筛选，所有的蚀斑都带有红色荧光，获得纯化的重组病毒(图2)。
图2表达红色荧光的重组DEV病毒
2.2.2重组病毒的鉴定
用鉴定引物ORFC17F/ORFC17R对重组病毒进行PCR扩增鉴定，得到大小约为2000 bp的片段(图3)，与理论值相符。
将PCR产物送北京华大基因生物公司测序，结果显示重组病毒缺失UL2基因，且带有RFP标记基团。
2.3一步生长曲线绘制
重组病毒及其亲本毒的一步生长曲线。图4结果表明，亲本毒接种CEF后48 h，病毒含量达到峰值106.5TCID50/0.1 mL，84 h上清样品病毒含量达到峰值106.75TCID50/0.1 mL。而表达红色荧光蛋白的重组病毒细胞的病毒含量在48 h达到峰值，为106.4TCID50/0.1 mL，上清样品的病毒含量在84 h达到峰值，为106.83TCID50/0.1 mL，与亲本毒无差异(P>0.05)。
图4重组病毒rDEV-ΔUL2-RFP的一步生长曲线
2.4重组病毒的传代稳定性
重组病毒经传代12次，荧光显微镜下观察红色荧光在1～12代均可稳定表达，所有产生CPE的细胞均带有红色荧光(图5)。重组病毒第5代、第10代、第12代PCR均扩增出2000 bp片段(图6)。测序结果表明，RFP序列未出现变异。
图5重组病毒的传代稳定性检测
3讨论与结论
本研究筛选并纯化了表达RFP的UL2基因功能缺失的重组鸭肠炎病毒，并对其生物学进行初步研究。研究表明该重组病毒的生长特性与亲本毒相似，并且可在CEF上连续稳定传代。与GFP相比，RFP在DEV中更稳定，至少在UL2基因内，RFP更适合重组DEV的反向筛选。
传统同源重组技术常以GFP、RFP、LacZ等作为重组病毒筛选标记基团，LacZ作为标记基团其缺点是分子量较大，不便于启动子克隆时重组质粒的构建，通过化学显色，检测灵敏度低，操作繁琐；荧光蛋白如GFP、RFP分子量小，发光强，操作简单，可直接在荧光显微镜下观察，易于检测，对基因功能、蛋白表达、定位示踪等诸多研究发挥了重要作用。但是目前已有研究表明，GFP在重组病毒中不稳定，随着传代次数的增加易发生点突变或缺失，Fang等构建表达GFP的北美1型猪繁殖与呼吸综合征的感染性克隆，拯救出含有GFP的病毒粒子，当病毒连续传代至第7代时，发现GFP基因发生突变；孙莹等研究显示表达GFP的重组鸭瘟病毒，绿色荧光在1～5代可以稳定表达，从第6代开始可观察到少量没有荧光的细胞病变，15～20代绝大部分细胞病变无绿色荧光，对重组DEV的筛选带来极大困难。红色荧光蛋白(RFP)出现较GFP稍晚，其可以激发和发射波长段也不同。本研究将RFP替代GFP，获得了一株表达红色荧光的重组DEV，且一步生长曲线表明RFP对DEV的生长无影响；RFP连续传代12代，能够稳定表达且无突变。试验证明RFP稳定性更强，与研究报道一致。根据本实验室在重组DEV筛选方面的经验，通常在10代以内就能够克隆纯化到重组病毒，因此本研究仅将RFP连续传代至12代，未进行更多的传代。本研究结果对重组DEV的构建、筛选具有很好的借鉴意义。