2结果与分析
2.1细菌分离
20份脑组织分别接种TSA平板，通过挑选可疑菌落，对其纯化，总共分出10株疑似菌株。在平板上可见灰白色、半透明、表面光滑、圆形、边缘整齐的小菌落。
2.2细菌鉴定分离
的10株细菌，用猪链球菌属引物gdh进行PCR鉴定，其中3株能扩增出约695 bp大小的条带，分别回收PCR产物进行测序，在NCBI上进行BLAST比对，显示与猪链球菌对应的序列同源性在95%以上，说明分离菌株为猪链球菌(图1)。
2.3 2型猪链球菌PCR鉴定
3株猪链球菌经过cas2J引物PCR鉴定，1株能扩增出长度约为387 bp大小的条带，回收PCR产物进行测序，发现所测序列片段大小和预期片段大小相同，同时把测出的序列结果在NCBI上进行BLAST比对，显示与对应血清型的序列同源性在95%以上，说明所扩增的基因即为目的基因(图2)。
M:DL2000 DNA Marker;1-10:疑似菌株;11:阴性对照M:DL2000 DNA Marker;1-10:suspicious strain；11:Negative control图1猪链球菌PCR鉴定结果
M:DL2000 DNA Marker;1-3:猪链球菌;4:阴性对照M:DL2000 DNA Marker;1-3:Streptococcus suis;4:Negative control图2 2型猪链球菌PCR鉴定结果
2.4毒力因子鉴定
分离的1株2型猪链球菌通过PCR检测了mrp、epf、sly、orf2、gapdh、fbps和89k 7种毒力因子，结果7种毒力因子在分离菌株中都能检测到(图3)。对上述菌株毒力基因测序分析，结果发现所测序列片段大小和预期片段大小相同，同时把测出的序列结果在NCBI上进行BLAST比对，显示与对应的毒力因子序列同源性在95%以上，说明所扩增的基因即为目的基因，分离菌株基因中几种主要毒力因子都有分布。
2.5形态学特性分离
的2型猪链球菌经过革兰氏染色后在显微镜下观察，细菌为革兰氏阴性细小杆菌，具有多种不同形态，可见单个的球杆菌、杆菌或丝状的菌体(图4)。
2.6生长曲线绘制
在液体TSB培养基中培养分离菌株，分离菌6 h左右开始进入对数生长期，培养8～10 h活菌数达到最高峰，但从10 h开始活菌数一直呈现下降趋势。分离菌株在TSB液体培养基繁殖速度快，活菌数高(图5)。
2.7小鼠攻毒试验昆明小鼠腹腔注射不同浓度的菌液后，试验小鼠最早于攻毒后第1天开始出现死亡现象，死亡高峰出现在攻毒后2～5 d，7 d后停止死亡。按Reed-Muench法计算，分离2型猪链球菌的LD50见表2。将浓缩菌液稀释到4.8×107CFU/mL，攻毒0.2 mL，能使半数小鼠发生死亡，表明分离菌株毒力较强。
图4革兰氏染色结果(100×)
图5 2型猪链球菌生长曲线
表2半数致死量(LD50)试验结果
2.8剖检观察剖检攻毒死亡小鼠，可见攻毒小鼠腹腔内渗出液增多，脑和各脏器出血；试验结束后剖检空白对照组小鼠，可见健康对照组小鼠腹腔及各器官正常。分离的2型猪链球菌能引起小鼠的急性败血症及脑膜炎，导致小鼠死亡，成功在小鼠上建立攻毒模型。
2.9脏器细菌分离
剖检死亡小鼠，取各脏器在无菌操作台内进行细菌分离，结果显示攻毒后死亡小鼠各脏器均能分离出细菌。对各脏器分离的细菌进行PCR鉴定并测序，结果表明各脏器分离菌株均为攻毒2型猪链球菌(图6)。
图6攻毒小鼠各脏器细菌分离鉴定
3讨论与小结
猪链球菌是一种重要的人畜共患病病原，其致病性差异很大，只有高致病力菌株才能引起猪脑膜炎、关节炎、心内膜炎、败血症、肺炎和突然死亡等症状，低致病力和无致病力的菌株常见于猪的呼吸道。在致病性血清型中2型的致病力最强，发病率最高，流行范围最广，其致病性和它的毒力因子相关。现有疫苗菌株分离年代都比较久远，保护效果有一定的降低。本研究采集最近几年疑似猪链球菌感染病例脑样品，经过平板分离和PCR鉴定成功获得一株2型猪链球菌，PCR检测显示分离菌株基因中几种主要毒力因子都有分布，在TSB液体培养基繁殖速度快，活菌数高，能引起小鼠的急性败血症及脑膜炎导致小鼠死亡，证明分离株毒力强，是潜在的疫苗菌株。
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